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WT1基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究

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WT1基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究

WTl基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究中文摘要目的采用实时荧光定量PCRRQ.PCR方法检测WTl基因在急性白血病患JLPb周血和骨髓中的表达,探讨WTl基因在检测微小残留病minimalresidualdisease,MRD中的价值。方法采用实时荧光定量PCR方法,检测23例初治急性白血病患儿、80例次完全缓解患儿外周血及骨髓中WTl基因的表达水平,以10例非肿瘤患儿为正常对照流式细胞术检测MRD,并同时观察白血病患儿疾病状态。23例初治急性白血病患儿包括16例急性淋巴细胞白血病ALL及7例急性粒细胞白血病AML,其中初治ALL组于治疗前、治疗第15天、33天及3个月,初治AML组于治疗前、治疗第15天、1个月、3个月分别采集外周血和骨髓标本,检测WTl表达。80例次完全缓解组患儿ALL56例次,AML24例次于治疗第3个月、6个月及12个月分别采集外周血和骨髓检测WTl表达阳性率。结果1、正常对照组儿童外周血及骨髓WTl表达阳性率均为0,初治白血病组患,SlA,b周血及骨髓WTl表达阳性率均为65.2%,初治白血病组外lIIIIIIIIIIIIIIIItillIY2338662周血及骨髓WTl的表达均明显高于正常对照组pO.001。ALL和AML外周血WTl表达阳性率比较,骨髓WTl表达阳性率比较,差异均无统计学意义p0.533。完全缓解患儿治疗第3个月、6个月外周血及骨髓WTl表达阳性率明显高于第12个月p均0.05。初治ALL患儿治疗前、15天、33天及3个月骨髓WTl表达量分别为0.7240.14、0.1640.06、O.12士O.02、O.120.05,各组间差异具有统计学意义F135.27,PO.05。所有初治ALL患儿皆于33天达完全缓解。3、初治AML患儿治疗前、15天、1个月及3个月外周血WTl表达量分别为0.70a0.07、0.20a0.06、O.18土0.05、0.1540.06,各组间差异具有统计学意义F139.29,PO.05。初治AML患儿治疗前、治疗第15天、1个月及3个月患儿骨髓WTl表达量分别为O.8710.04、0.240.05、0.21士0.05、O.18士O.10,各组间差异具有统计学意义F241.29,PO.05。全部初治AML患儿皆于12个月内获得完全缓解。4、初治ALL患JLJ,l周血WTl表达量与MRD成正相关,FO.999,PO.05.WTlgeneexpressionshowed0.7240.14、0.1640.06、O.12士O.02、O.12士O.05inBMcellsbeforetreatmentandonthe15thday、33thdayandthirdmonthrespectivelyindenovoALLchildren,significantdifferencewasfoundF135.27,pO.05.16denovoALLchildrenwerecompleteremissiononthe33thday.3WTlgeneexpressionshowed0.700.07、0.200.06、O.180.05、O.150.06inPBcellsbeforetreatmentandonthe15thday、firstmonthandthirdmonthrespectivelyindenovoAMLchildren,significantdifferencewasfoundF139.29,p0.05.WTlgeneexpressionshowed0.870.04、0.2410.05、0.210.05、O.180.10inBMcellsbeforetreatmentandonthe15thday、firstmonthandthirdmonthrespectivelyindenovoAMLchildren,significantdifferencewasfoundF241.29,pO.05.7denovoAMLchildrenwerecompleteremissiononthefirstmonth.4MRDwaspositivelyrelatedtoWT1genelevelsinPBrO.999,PO.001.MRDwaspositivelyrelatedtoWTlgenelevelsinBMrO.997,p0.001.5Whenthepatientswererelapsed,theWTlgenelevelsincrease.Conelusions1TherealtimequantitmivePCRassayhasgoodsensitivity,repeatabilityandspecificity.2Therewasnoexpressioninchildrenwithoutmalignantdisease,buttheexpressionwashighbeforetreatmentindenovoALchildren.3ThelevelsofWT1geneincompleteremissiongroupwerelowerthanindenovoALchildren.4Withthedevelopmentoftreatment,thepositiveexpressionrateofWTlwasdeclinedsignificantly.5MRDwaspositivelyrelatedtoWT1genelevelsindenovoALLchildren.MonitoringWT1withRQPCRcanactasamethodtodetectminimalresidualdiseaseinchildrenwithacuteleukemia.PostgraduatestudentYinShuanpeadiatriesDirectedbyProfiLiXuerongKeywordsWTlAcuteleukemiaMinimalresiduediseaseRealtimequantitativePCR目录弓I言1第1章材料与方法21.1材料21.1.1研究对象21.1.2实验试剂21.1.3实验仪器31.2WTl定量分析方法41.2.1标本采集与保存41.2.2总RNA的提取41.2.3RNA浓度检测及鉴定51.2.4eDNA的合成51.2.5PCR反应61.3流式细胞仪MRD检测71.4数据处理71.5统计学处理8第2章结果92.1荧光定量PCR方法的准确性和特异性检测92.1.1引物特异性检测92.1.2扩增曲线102.1.3溶解曲线_102.2急性白血病与正常对照组wTl表达阳性率比较112.2.1急性白血病与正常对照组外周血WTl表达阳性率比较112.2.2急性白血病与正常对照组骨髓WTl表达阳性率比较112.3初治ALL与AML患儿wTl表达阳性率比较112.4完全缓解组WTl表达阳性率比较122.4.1ALL完全缓解患儿治疗不同时间外周血WTl表达阳性率比较122.4.2AML完全缓解患儿治疗不同时间外周血wTl表达阳性率比较122.4.3ALL完全缓解患儿治疗不同时间骨髓wTl表达阳性率比较132.4.4AML完全缓解患儿治疗不同时间骨髓WTl表达阳性率比较132.5初治急性白血病患儿不同时期WTl表达水平比较142.5.1ALL患儿不同时间外周血WTl表达水平比较142.5.2ALL患儿不同时间骨髓WTl表达水平比较152.5.3AML患儿不同时间外周血WTl表达水平比较162.5.4AML患儿不同时间骨髓WTl表达水平比较172.6初治组WTl定量水平与流式细胞术检测MRD相关性182.6.1初治ALL外周血WTl定量水平与流式细胞术检测MRD关系182.6.2初治ALL骨髓WTl定量水平与流式细胞术检测MRD关系182.7急性自血病治疗疗效观察和复发患儿WTl表达19第3章讨论21结论23参考文献24

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