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藏红花素对急性白血病患儿骨髓间充质干细胞增殖及功能的影响

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藏红花素对急性白血病患儿骨髓间充质干细胞增殖及功能的影响

摘要目的研究化疗及不同浓度藏红花素对急性白血病患儿骨髓间充质干细胞BMSCs增殖及功能的影响。方法收集正常儿童,新发急性白血病患儿,化疗6个月及化疗1年后的急性白血病患儿骨髓各lO例,全骨髓法培养出BMSCs,分别设为正常对照组A,实验组分为新发组B,化疗6月组C及化疗12月组D,并通过流式细胞仪测定细胞表面标记分子CD44、CDl05、CD29、CD73、CD34、CD45及HLADR的表达率,进行BMSCs鉴定。用含不同浓度藏红花素0、0.3125mg/ml、0.625mg/ml、1.25mg/ml及2.5mg/m1的低糖DMEMLDMEM培养液分别培养各组BMSCs48h、72h及96h。倒置显微镜观察各组BMSCs形态及增殖情况MTT法检测经不同浓度藏红花素、不同时间作用后的各组BMSCs增殖率ELISA法测定作用96小时后各组细胞上清液干细胞因子SCF及肿瘤坏死因子一aTNF_a的水平。结果1.BMSCs膜抗原表达各组均有99.5%以上细胞表面表达CD44、CDl05、CD29及CD73,而表达CD34、CD45及HLADR的细胞均低于2%。2.BMSCs形态学变化A组BMSCs形态规则,呈集落样或结网样迅速增殖,B组BMSCs形态较规则,但增殖速度明显低于正常对照组C及D组BMSCs形态不规则,增殖速度明显低于A组。3.BMSCs增殖活性实验各组BMSCs在藏红花素作用前培养48h、72h、96h后所测得OD值均低于A组OD值,差异有统计学意义p0.05,培养72h及96h后,D组0D值明显低于C组OD值,差异有统计学意义,pO.05加入不同浓度藏红花素培养96h后,BMSCs增殖率均明显提高F值分别为19.85、5.42、9.31、9.58pO.05,当藏红花浓度从0.3125mg/ml1.25mg/m1时,增殖率逐渐增加,以藏红花素浓度为1.25mg/ml时的增殖率最高,与其他各组比较均有显著性差异仄0.05,当藏红花素浓度升高至2.5mg/ml时,各组细胞增殖率反而下降。4.BMSCs产生SCF及TNF_Q水平B组细胞产生SCF及TNFa水平较A明显升高p0.05,C及D组明显低于B组p均0.05,D组明显低于C组pO.05,但C组TNFa水平仍显著高于A组p0.05。藏红花素作用后,A组细胞上清液中SCF水平明显下降F25.49pO.05,以1.25mg/ml浓度组最低C及D组经藏红花素作用后,{一I删删坠上清液SCF平明显升高F4.69,17.46pO.05,以1.25mg/ml组最高,而A及C组经浓度为0.625mg/ml及1.25mg/ml藏红花素作用后,上清液中TNFQ水平明显下降F5.58,6.12pO.05,亦以1.25mg/ml浓度组下降最明显。结论1.急性白血病忠儿治疗前BMSCs的形态及细胞表型与正常BMSCs无明显差异,但其增殖活性明显降低,产生SCF及TNFQ水平异常增高,提示急性白血病患儿骨髓发生了造血微环境的紊乱。2.化疗6月后急性白血病患LBMSCs贴壁较前缓慢,形态不规则,增殖活性及产生SCF及TNFQ水平均明显降低,提示化疗可损伤BMSCs的形态、增殖活性及功能。3.化疗12月后急性白血病患儿BMSCs增殖活性及产生SCF及TNFQ水平均较化疗6月后明显减低,提示化疗强度越大,对BMSCs的损伤越明显。4.治疗前急性白血病患LBMSCs经藏红花素作用后,增殖活性无明显改变,但产生SCF及TNFQ水平较前明显降低,提示藏红花素可调节急性白血病患儿造血微环境紊乱。.5.化疗6月后急性白血病患儿BMSCs经藏红花素作用后产生TNFa的水平明显降低,提示藏红花素可减轻造血抑制。6.化疗6月及12月后急性白血病患LBMSCs经藏红花素作用后其增殖活性及产生SCF的水平明显升高,提示藏红花素可促进化疗后受损的BMSCs增殖活性及功能的恢复。硕士研究生李丹妮儿科学指导教师孙立荣教授关键词骨髓间充质干细胞藏红花素增殖活性干细胞因子肿瘤坏死因子AbstractObjectiveTheobjectiveofthepresentstudywastoassesstheeffectsofadjuvantchemotherapyandcrocinonbonemarrowmesenchymalstemcellsBMSCsofchildren嘶thacuteleukemiam.Methods硼1eBMSCsseparatedfromthebonemarrowsharvestedfrom30childrenwithALand10normalchildrenweredividedintofourgroupsPrechemotherapygroupB,6monthchemotherapygroupC,12一monthchemotherapygroupDandtheNormalcontrolgroupA.AfterbeingidentifiedbyFlowcytometry,theBMSCswerecultured谢mL.DMEMincludingcrocinofdifferentconcentrations0,0.3125mg/ml,0.625m酌【111,1.25m酌nland2.5mg/rrdfor48h、72hand96hrespectively.mmorphologyandthemultiplicationmteoftheBMSCswasobservedbyfluorescencemicroscopy,theprolifcrativeactivityoftheBMSCsWasassayedbyMTTandtheconcentrationsofSCFandTNFaWasdetectedbyELISAassay.111edataWasanalyzedbySPSS17.0.Results1.1f11cexpressionofmembraneantigentheproportionsofcellsexpressingCD44、CD105、CD29andCD73inthefourgroupswereallabove99.5%,andcellsexpressingCD34、CD45andHLA.DRwerealllessthan2%.2.CellmorphologyofBMSCsthemorphologyofthecellsfromAgroupandtheBgroupweremoreregular,andthedoublingtimeforcellsfromtheAgroupWasmuchfasterthancellsfromtheotherthreegroups,especiallytheDgroup.Afteraffectedbythecrocinofdifferentconcentration,therelativeproliferationrateofthecellswasdramaticallyimproved.3.nleproliferativerateofthecellsaftercultured48h、72hand96hwithLDMEM,theODvalueoftheAgroupwashigherthanothergroupsF19.85、5.42、9.31、9.58p0.05,theODvalueofCgroupWashigherthantheDgroupafter72hand96hp0.05.Whenculturedwithcrocinofdifferentconcentration,therelativeproliferationrateofthecellsbecamemoreandmorehigheraStheconcentrationofthecrocinelevatedfrom0.3125mg/mlto1.25mg/rulpo.05,buttherateWasdecreasedwhentheconcentrationbecame2.5mg/rnl.4.nleconcentrationsofSCFandTNF.aproducedbyBMSCsafterbeenculturedfor96hwithL.DMEMtheamountofSCFandTNF.aproducedbyBgroupcellsWasmuchmorethanothergroupspO.05,andtheamountofthe.CandDgroupsWaSmuchless,especiallytheDgroup.Whenculturedwithcrocinof1.25mg/rrd,thelevelofSCFandTNF伍producedbytheBgroupWaSdramaticallylowerthanothergroupsp0.05,thelevelofSCFproducedbythecellsoftheCandDgroupswasmuchhigherthanothergroupsp0.05.Conclusion1.111eBMSCsofthechildrenwithacuteleukemiahavethesalnemorphologyandphenotype弱thenormalones,buttheirproliferativerateandtheSCFandn师aamountaremuchless,revealingthattheHematopoieticmicroenvironmentofthechildrenwasindisorders.2.Afterreceivingchemotherapyfor6months,themorphologyoftheBMSCsofchildrenwithacuteleukemiabecameirregular,theproliferationslower,andtheconcentrationsofSCFand曰叼P.alower,revealingthatchemotherapyCalldamagetheBMSCs.3.Afer12monthSchemotherapythedamageoftheBMSCswasmoreobvious,revealingthatthehigherthechemotherapydose,themoreseriousthedamageis.4.Crocinof1.25mg/mlcanregulatethesickhematopoieticmicroenvironmentoftheacute1eukemiabyreducingtheabnormalamountofSCFandTNFaamount.5.CrocinCandecreasethethesecretionofTl虾aoftheBMSCsafterchemotherapy,revealingthatitCanlessentheinhibitionofhematogenesis.6.CrocincanpromotetheproliferationrateandincreasethesecretionofSCFoftheBMSCsdamagedbychemotherapy,whichisdosedependentwiththe1.25mg/mlasthepeakconcentration.PostgraduatestudentLiDanniPediatricsDirectedbyProf.SunLirongKeywordsbonemarrowmesenchymalstemcellsBMSCscrocinproliferationSCFTNFa目录引言.1第一章材料和方法31.1实验材料..31.1.1骨髓来源31.1.2主要试剂31.1.3仪器设备31.2方法41.2.1藏红花素溶液的配制..41.2.2人骨髓间充质干细胞BMSCs的体外培养.41.2.3BMSCs的鉴定..51.2.4M仃法检测BMSCs增殖活性..51.2.5ELISA法检测BMSCs产生细胞因子SCF及TNFa的水平..51.2.6统计学方法.6第二章结果72.1BMSCs形态及增殖.72.2BMSCs表面分子表达.82.3化疗对急性白血病患儿BMSCs增殖的影响.92.4化疗对急性白血病患儿BMSCs产生细胞因子的影响..92.4.1化疗对急性白血病患儿BMSCs产生SCF的影响..92.4.2化疗对急性白血病患儿BMSCs产生TNF_Q的影响.102.5藏红花素对急性白血病患儿BMSCs增殖的影响..112.6藏红花素对急性白血病患儿BMSCs产生细胞因子的影响122.6.1藏红花素对急性白血病患儿BMSCs产生SCF的影响122.6.2藏红花素对急性白血病患儿BMSCs产生.TNFⅡ的影响12第三章讨论..143.1BMSCs的分离培养与鉴定。143.2急性白血病时BMSCs的变化.143.3化疗对BMSCs的损害.163.4藏红花素可修复化疗后受损BMSCs..17第四章结论..18参考文献.19综述...22综述的参考文献.30攻读学位期间的研究成果.....32附录33致谢...34学位论文独创性声明35学位论文知识产权权属声明36引言引言急性自血病是儿童最常见的恶性肿瘤,严重威胁儿童健康和生命安全。目前,联合化疗是急性白血病的主要治疗方法,其疗程较长,如对于急性淋巴细胞性白血病ALL患儿,化疗疗程需长达到2.53年。化疗药物大多为细胞毒性药物,在杀灭肿瘤细胞的同时也会损伤增殖活跃的正常骨髓细胞,包括造血干细胞及间充质千细胞。导致化疗后造血恢复缓慢,骨髓抑制期延长,使患儿易于合并出血、感染等并发症,导致化疗中断甚至危及生命。骨髓间充质干细胞bonemarrowmesenchymalstemcell,sMsc是骨髓中除造血干细胞外的另一类干细胞,呈成纤维细胞样,可分化为成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞及纤维细胞,是造血微环境的重要组成部分,在正常情况下对于造血干细胞的增殖、分化起着关键作用H。主要表现为1通过某些特殊结构与造血细胞密切接触而起到支持和营养造血实质细胞的作用2表达多种黏附分子,通过黏附分子受体使造血细胞同基质细胞相互黏附,产生细胞内调节信息传递与细胞反应,刺激或抑制造血细胞的增殖及分化,保持造血干细胞池有序的造血,造血干/祖细胞归巢、移行以及血细胞的释放等3通过表达和分泌多种造血调控因子,包括造血刺激因子和造血抑制因子,从正反两方面调节造血以维持机体造血的动态平衡¨o。而研究表明,大剂量化疗可直接导致BMSCs形态学改变、生长受抑以及粘附功能和造血支持能力的损伤,使其对造血细胞的粘附作用减弱、分泌的细胞外基质和造血细胞因子减少,使得BMSCs对造血干细胞的支持及促进作用明显减弱,进而严重影响化疗后造血恢复n。因而寻找一种毒副作用低,促进化疗后受损骨髓间充质干细胞增殖及功能恢复的药物对于提高化疗疗效,促进化疗后造血恢复、减少化疗并发症及提高患儿生存质量具有重大意义。既往研究表明,许多中药可以促进BMSC的增殖及功能。如黄芪、红景天苷等中药可促进正常人或小鼠BMSCs的增殖和分泌,川芎嗪等可以减轻化疗所致BMSCs损伤,促进造血恢复。黄芪注射液能够促进小鼠骨髓基质细胞的增殖,并能提高骨髓基质细胞vC肿1、ICAM一1蛋白表达水平,表明黄芪能够增强骨髓基质细胞的黏附性,提示黄芪通过促进骨髓基质细胞的增殖和提高黏附分子的表达,可以促进造血细胞黏附定位于所发育的骨髓微环境,改善造血微环境,进而促进造血细胞的增殖和分化12。藏红花saffron,CrocussativusL.,又称西红花,是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉,也是一种名贵的中药材,具有强大的生理活性,其柱头在亚洲和欧洲作为药用,有镇静、祛痰、解痉作用,用于胃病、调经、麻疹、发热、黄胆、肝脾肿大等的治疗培。其柱头的主要化学成分藏红花素及藏红花酸等已被证明具有抗肿瘤,调节免疫,保护肝胆及心血管系统的作用州6,这些作用对于需长期化疗的白血病患儿的恢复及各脏器功能的保护都具有重大意义。但目前国内外尚未见藏红花1青岛大学硕士学位论文素对化疗后BMSCs影响的研究报道。本实验通过检测藏红花素对化疗后急性白血病患儿体外培养BMSCs增殖及分泌的影响,进一步了解其能否促进化疗后造血功能的恢复。2第一章材料和方法1.1实验材料第二章材料和方法1.1.1骨髓来源正常对照组A10例,取自血液病研究室健康儿童。实验组30例,取自青医附院小儿血液科2012年1月2012年7月收治的急性白血病患儿,分为3组,①新发组B,新发急性自血病患儿10例急性淋巴细胞白血病7例,急性粒细胞自血病3例,②化疗6月组c,化疗半年的急性白血病患儿10例急性淋巴细胞白血病7例,急性粒细胞自血病3例③化疗12月组D,化疗1年的急性白血病患儿10例急性淋巴细胞自血病7例,急性粒细胞白血病3例。其中,化疗6月组及化疗12月组患儿均于诱导缓解化疗期间达完全缓解。1.1.2主要试剂试剂藏红花素甲基噻唑基四唑姗TPBS磷酸盐缓冲液胎牛血清FcS胰酶低糖DMEM培养液DMSOELISA试剂盒1.1.3仪器设备仪器BTlf一II型微电脑超净工作台一20℃一4℃普通冰箱OlympusIXTO/CK40倒置显微镜Son,W80数码摄机医用离心机来源美国Sigma公司美国Sigma公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国Hyclone公司美国Hyclone公司美国Hyclone公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国脚公司r家青岛康净新技术开发有限公司青岛海尔集团日本OLYMPUS日本Sony北京医用离心机厂3

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