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单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究

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单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究

硕士学位论文论文题目单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究研究生姓名王波指导教师姓名严文华专业名称儿科学研究方向心血管论文提交日期2013年3月单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究中文摘要I单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究中文摘要目的本实验以先天性室间隔缺损(Ventricularseptaldefect,VSD)患者为研究对象,以正常儿童为对照,从基因遗传和环境因素两方面着手探讨先天性心脏病CongenitalHeartDisease,CHD致病因素,为CHD的病因研究及预防提供参考。方法运用PCRDNA测序技术对43例VSD患者及188例正常儿童进行NKX25外显子1的测序,运用SNaPshot基因分型技术分别检测43例VSD患者及188例正常儿童叶酸代谢通路上11个酶基因的13个单核苷酸多态位点(singlenucleotidepolymorphisms,SNP),同时对CHD患者和正常儿童的父母进行访谈式的关于CHD相关危险因素的问卷调查,共完成116例患者和161例正常对照的有效问卷,并对结果进行统计分析。结果1对43个VSD样本和188个正常样本进行NKX25外显子1测序,结果未发现任何基因突变,找到1个已报道的SNP位点,c.63A>G,其两组间基因型分布及等位基因频率无统计学差异,P>0.05。2在43个VSD样本和188个正常样本中,MTHFDG878A仅检测到野生型,未检测到突变。CBSC699T仅检测到野生型/和杂合突变型/。其余11个位点皆检测到三种基因型野生型/、杂合突变型/和纯合突变型/。VSD组和对照组比较显示VSD组携带RFC1G80A的AA基因型频率39.5显著高于对照组27.7,P0.05,OR4.47,95CI1.60,12.48VSD组中DHFRc59459del19的GG基因型在VSD和对照组中的分布频率分别为34.9和45.2,前者显著低于后者,P0.05,OR0.39,95CI0.15,0.98。其他位点的杂合突变或纯合突变在VSD和正常对照组中的频率分布无显著差异,P>0.05。3对CHD患儿是否存在父系或母系先天性心脏病家族史和患儿母亲怀孕早期有无感冒、孕期有无吸烟或被动吸烟等相关因素变量进行二值Logistic回归分析,孕中文摘要单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究II早期有无感冒(B0.988,Wald9.463,P0.002)、母亲家系中是否有CHD患者(B2.423,Wald8.780,P0.003)、父亲家系中是否有CHD患者(B2.355,Wald4.180,P0.041)三个变量与CHD的发生有关。结论1NKX25外显子1测序未发现基因突变。NKX25外显子1上的c.63A>GSNP位点与VSD之间无明显相关。2RFC1G80A的AA基因型构成VSD的独立风险因素,而DHFRC59459DEL19纯合缺失可能是VSD发生的保护因素。3CHD是以遗传因素为主导的多基因遗传病。孕早期是胎儿心脏发育的关键时期,孕早期感冒可能引起CHD的发生,加强孕早期保健防护,对预防CHD发生具有重要现实意义。关键词先天性心脏病室间隔缺损单核苷酸多态性NKX25SNaPshot基因分型叶酸代谢酶危险因素作者王波指导老师严文华TheinitialresearchofSNPsincongenitalventricularseptaldefectAbstractIIITheinitialresearchofSNPsincongenitalventricularseptaldefectAbstractObjectiveInthisstudy,ittakespatientswithcongenitalventricularseptaldefectastheobjectandnormalchildrenascontrol.Andatthesametime,surveystotheparentsofCHDpatientsandnormalchildrenaretoexploretheriskfactorsofCHDandtoprovideareferencefortheetiologyresearchandpreventionofCHD.MethodsUsePCRDNAsequencingtechnologytodetectexonⅠofthegeneNKX25inthe43casesofVSDand188normalchildrenuseSNaPshotgenotypingtechnologytodetect13SNPsof11enzymegenesrelatedtofolicacidmetabolismof43casesofVSDand188normalchildrensurveytheparentsof116CHDpatientsand161controlsabouttheriskfactorsofCHDwithinterviewstyle.Anddostatisticalanalysisabouttheresults.Results1NomutationwasfoundintheexonⅠoftheNkx25gene,WhilewefoundanAtoGtransitionatnucleotide63Glu21Glu.Furtherstudypresentedthattherewerenostatisticdifferencesofthegenetypefrequencyandallelefrequencybetweenventrialseptaldefectpatientsandnormalcontrols,P>0.05.2NomutationwasfoundinMTHFDG878A.NoGGgenetypewasfoundinCBSC699T.SNPRFC1G80AmightincreasetheriskofVSD,andDHFRc59459del19mightdecreasetheriskofVSD.TheratiosofthetwoSNPsbetweenventrialseptaldefectpatientsandnormalcontrolsareofstatisticdifferencestheAAgenotypeofFC1G80A,OR4.4795CI1.60,12.48,P0.05theGGgenotypeofDHFRc59459del19,OR0.3995CI0.15,0.98,P0.05.3Usinglogisticregressionanalyzetheriskfactorsvariablesinthequestionnaires.ThemothercatchingacoldornotduringtheearlypregnancyB0.988,Wald9.463,P0.002,whethertherearematernalCHDfamilyhistoryB2.423,Wald8.780,PAbstractTheinitialresearchofSNPsincongenitalventricularseptaldefectIV0.003,whethertherearepaternalCHDfamilyhistoryB2.355,Wald4.180,P0.041arerelatedtotheoccurrenceofCHD.Conclusion1NomutationwasfoundintheexonⅠoftheNkx25gene.NosignificantlydifferencebetweenthepatientswithventricularseptaldefectandcontrolgroupwasfoundinthedistributionofalleleandgenotypeoftheSNPc.63A>G.2TheAAgenotypeofRFC1G80AisasusceptiblefactorforVSD.TheGGgenotypeofDHFRc59459del19isaprotectivegenotypeforVSD.3Earlypregnancyisacriticalperiodoffetalheartdevelopment.MaternalcoldmaycauseCHD.StrengtheningearlypregnancyhealthcarehastheimportantrealisticsignificancetopreventtheoccurrenceofCHD.KeywordsCongenitalheartdiseaseVentricularseptaldefectsinglenucleotidepolymorphismsSNaPshotgenotypingtechnologyNKX25Folaterelatedmetabolismenzymeriskfactor.WrittenbyWangBoSupervisedbyYanWenhua目录前言............................................................................................................................1第一部分先天性室间隔缺损中NKX25外显子1的突变筛查...................................3材料与方法................................................................................................................3结果.....................................................................................................................7讨论.....................................................................................................................9第二部分叶酸代谢相关酶基因SNPs与先天性室间隔缺损的关系探讨..................11材料与方法...............................................................................................................11结果...................................................................................................................13讨论...................................................................................................................18第三部分先天性心脏病危险因素问卷调查..............................................................24对象与方法..............................................................................................................24结果...................................................................................................................24讨论...................................................................................................................25结论........................................................................................................................27研究的局限性................................................................................................................28研究的创新性和展望.....................................................................................................29参考文献........................................................................................................................30综述........................................................................................................................38英文缩略词表................................................................................................................50攻读学位期间公开发表的论文......................................................................................52致谢........................................................................................................................53单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究前言1前言先天性心脏病CongenitalHeartDisease,CHD,简称先心病,是胚胎发育时期心血管系统发育异常或出生后应该退化的组织未曾退化所造成的心血管畸形,是由于控制人类心血管系统发育的基因发生突变以及这些基因在环境因素影响下发生时间(发育阶段)和空间(组织特异性)调控表达失误所造成的心血管畸形。CHD是最常见的出生缺陷之一,其发病率约为活产婴儿的1%1,是5岁以下儿童非感染性疾病中最主要的死亡原因2。心血管系统是人体最早发育的系统之一,在妊娠的前三个月就基本发育完成。在细胞不断分裂和组织不断分化成熟的这一时期,处在发生和发展的心血管系统极易遭受不良的宫内环境及其他环境因素的影响。研究表明,不良的环境因素及遗传因素的相互作用可直接影响胎儿心血管系统的分化、发育和成熟,导致胎儿发生各种各样的心脏畸形3。各种先天性心脏畸形中又以室间隔缺损(Ventricularseptaldefect,VSD)的发生率最高4。最早在1847年Dalrymple进行了关于室间隔缺损的报道。它是指由于心室的间隔部分组织缺损形成异常开口而引起左右心室间异常的血流交通,从而造成血流动力学改变的一种先天性心脏缺损。虽然先天性心脏病的病因和发病机制尚未完全明确,但目前多数学者认为CHD的发生是由遗传因素和环境因素共同作用引起的5。单核苷酸多态性是人类基因组最常见的多态,遍布于人类基因组中,主要是指由于基因组中单个核苷酸的变异导致了个体与个体之间的差异。目前在公共数据库有过报道并经过确认的SNP在已经超过2700万,近几年来,研究者们在单核苷酸多态性与先心病的研究中已经取得了不少进展6。本课题中我们从基因遗传和环境因素两方面着手,运用PCRDNA测序技术对43例VSD患者及188例正常儿童进行NKX25外显子1的测序,运用SNaPshot基因分型技术分别检测43例VSD患者和188例正常儿童进行叶酸代谢通路上的11个酶基因的13个多态位点,包括CBSC699T、DHFRc59459del19、GST01C428T、MTHFDG878A和G1958A、MTHFRC677T和A1298C、MTRA2756G、MTRRA66G、NFE2L2ins1C11108T、RFC1G80A、TCN2C776T和TYMS1494del6,同时根据文前言单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究2献611设计调查问卷,调查内容涉及CHD患儿是否有父系或母系先天性心脏病家族史和孕母早期是否感冒、是否吸烟或被动吸烟等。从而探讨VSD的发病机制及CHD的环境易感因素,为CHD的遗传咨询和早期诊断提供参考,进而采取有效的预防措施,以期减轻CHD给社会和家庭造成的严重的经济和精神负担。单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究第一部分3第一部分先天性室间隔缺损中NKX25外显子1的突变筛查材料与方法1.材料1.1研究对象2010年10月2012年10月在苏州大学附属儿童医院住院,通过经胸心脏彩超、心电图、胸部X线、临床症状及体征明确诊断为CHD的患儿116名及同期在苏州市立医院门诊正常体检的健康儿童188名,向其父母提供知情同意书并获签字同意后,抽取患儿外周静脉血2ml于紫色EDTA抗凝管中,20℃冰箱保存。116名CHD患者中男55例,女61例,年龄最小2月,最大11岁,平均4.76岁。其中室间隔缺损43例,房间隔缺损27例,动脉导管未闭26例,肺动脉瓣狭窄7例,法乐氏四联征5例,还有8例系先天性复杂性心脏病。188名正常儿童中男102例,女86例,年龄最小3月,最大9岁,平均4.27岁,经心脏彩超排除CHD。1.2主要试剂1.2.110mMdNTP0.5ml,SAP酶(1.0U/μL)promega公司,美国)1.2.225mMMgCl21.25ml(NEB,新西兰)1.2.310xSequenceBuffer、5xSequenceBuffer、6xloadingBuffer(NEB,新西兰)1.2.4ddH2O(Millipore,美国)1.2.5TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、ExonⅠ酶(大连takara公司,中国)1.2.6NH4AcEDTA、HiDi、BDT(上海捷瑞生工,中国)1.2.7NKX25外显子1引物、100bpDNAMaker、pu19Maker(上海捷瑞生工,中国)1.2.8QiagenMiniBloodkit(Qiagen公司,荷兰)

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