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端粒酶活性和相关基因在再障患儿骨髓造血干细胞中表达的研究

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端粒酶活性和相关基因在再障患儿骨髓造血干细胞中表达的研究

AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyontheExpressionofTelomeraseActivityandItsRelatedGenesinMarrowHemopoieticStemCellsofChildrenwithAplasticAnemiaByYujieZhouSupervisorProf.XigeWangPediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2013原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者日期p乃年∥月』日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者酗日期纠孓年厂月,目摘要端粒酶活性和相关基因在再障患儿骨髓造血干细胞中表达的研究研究生周玉洁导师王西阁教授专业儿科学郑州大学第三临床学院河南郑州450052摘要再生障碍性贫血简称再障,AplastieAnemia,AA是由多种因素包括物理、化学、生物、药物及其他尚不完全明确的因素造成骨髓造血衰竭的血液系统疾病,既往认为主要病理机制为骨髓造血干细胞数量和质量的异常及骨髓造血微环境的破坏,临床表现为全血细胞的减少。该疾病治疗疗程长,治疗效果差,病死率高,严重危害患者身心健康。然而直至目前,再障的发病机制仍不完全明了。既往研究认为AA的发病机制与免疫细胞及其活化信号异常密切相关。而最近国内外相关研究提示遗传易感性特别是某些基因水平的异常改变在AA发病机制中发挥着不容忽视的作用。其中端粒酶活性及相关基因表达的异常在再障发病机制中的意义,越来越引起血液学研究者们的关注和兴趣。端粒是真核细胞中染色体末端的特殊结构,能保护染色体在细胞分裂过程中,保持自身结构和功能的完整性,避免染色体发生端端融合、重组和丢失。但端粒自身存在与年龄相关的长度缩短,此时需要一种特殊的酶端粒酶来补偿这种丢失而维持端粒长度。端粒酶由端粒酶RNA组分TERC与端粒酶逆转录酶TRET构成,它能够以自身携带的RNA为模板在染色体末端添加端粒重复序列,在维持端粒长度和稳定性方面发挥重要作用。当端粒缩短至一定范围时,端粒酶活性表达的有无具有至关重要的作用。有研究表明再生障碍性贫血患者外周血粒细胞端粒长度缩短,且缩短程度与患者疾病持续时间存在相关性【11。儿童骨髓造血干细胞增殖潜能较成人高,端粒相对缩短不明显,那么再摘要障患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性水平表达如何,是否随端粒长度改变而变化,上述两个端粒酶基因的表达在再障发病过程如何变化,目前尚未见相关研究报道。因此为明确以上疑问,我们进行了以下研究。目的探讨AA患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性及端粒酶逆转录酶hTEI玎基因●和端粒酶RNA组分hTERC基因的表达变化和关系,为再障诊治及其判断预后寻找新的参考指标。材料与方法收集2011年6月.2012年6月郑州大学第三附属医院及第一附属医院经临床和实验室初次确诊的再障忠儿65例为病例组,其中慢性再障CAA52例,急性再障SAA13例,同时收集郑州大学第三附属医院就诊并严格排除血液系统疾病及其他重大恶性肿瘤患儿21例作为对照组。3组患儿既往均未给予输血及免疫抑制治疗,且年龄、性别差异无统计学意义。用重复序列扩增TRAP.PCR银染法检测3组患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性,用实时荧光定量RTPCR法分别检测hTERTmRNA和hTERCmRNA的表达水平。结果采用SPSS17.0统计软件进行分析,定量资料采用均数±标准差x±艿表示,多组间比较以单因素方差分析进行,组间比较采用LSD法,关联分析则采用线性相关分析,P≤0.05为差异有统计学意义,以a0.05为检验水准。结果1.端粒酶活性表达水平CAA组为41.35±10.28、SAA组端粒酶活性31.86±8.54明显高于对照组23.50±9.13P0.01,且CAA组平均端粒酶活性较SAA组升高氏O.052.hTERTmRNA的表达水平CAA组为9.86±1.10,SAA组为5.12±O.89,均高于对照组1.17t0.73,差异有统计学意义PO.05,且CAA组高于SAA组,差异有统计学意义氏0.013.hTERCmRNA表达水平CAA组为1.23±0.50,SAA组为1.13±0.45,lI摘要对照组为1.18±O.64,三组间差异无统计学意义P0.8124.端粒酶活性、hTERTmRNA及hTERCmRNA表达相关性端粒酶活性高低与hTERTmRNA表达呈正相关,.0.660,P0.01,hTERCmRNA的表达与端粒酶活性无明显相关性P0.193,hTERTmRNA与hTERCmRNA表达无相关性P0.746。结论1.再障患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达水平升高,且慢性再障儿童两者表达均高于急性再障患儿,hTERT是端粒酶活性表达的控制因素。2.端粒酶活性的表达变化与儿童再障发病及发展过程有关,hTERT表达在端粒酶活性调节过程中起重要作用。关键词再生障碍性贫血端粒酶骨髓造血干细胞儿童IIIStudyontheExpressionofTelomeraseActivityandItsRelatedGenesinMarrowHemopoieticStemCe11sofChildrenwithAplasticAnemiaPostgraduateYujieZhouSupevisorProfXigeWangDepartmentofpediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhouHenan450052AbstractAplasticAnemiaAAisahematologicalsystemicdiseasecausedbvdif氨汀entklndsofreasons,includedphysical,chemical,biologicalandotherinde硒itedtactorS,1nwhichthebonemarrowhematopoieticfunctionfailure.Itmanifestsbonem猢whematopoieticstemcellsandbonemarrowmicroenViro啪entseVerelvdarflagedandleadstopancytopeniaeventually.Thediseasehaslongtreatmentduratlon,lowcurativerate,andhighmortality,SOitbringsgreatphysicallyaIldmentallyharllqtothepatients.However,thepathogenesishavenotbeencomprehensivelyunderstooduptonOW.ResearchersbelievethatthemajormechanismofaplasticaJlellliahasareIationwlththeabnormalitiesofimmunocyteanditsactivationsignals.HoweversomestlldlesshowthattheGeneticSusceptibilityproducesamarkedeffectinaplastic8nelllla,especiallythemutationsandchangesofsomegenesarenoticedbymoreandmoreresearchersThehematologicresearchershavepaycloseattentionandmoreIntreastsontheexpressionoftelomeraseactivityanditsrelatedgenesinthepathogenesisofaplasticanemia.TelomeresarespecializednucleoproteinstructuresformedcapsattheterminalendSofchromosomesineucaryoticcells.ThemainfunctionoftelomeresistocaptheIVAbstractchromosomeendsinordertoprotectchromosomeendsfromendtoendfusion,recombination,anddegradation.Butthelengthoftelomerewillbehaveashorteningrelatedwithaging,atthistimeaspecialenzymecalledtdomeraseisoftenrequiredtosynthesizetelomereDNAforcompensatingfortheshortening.TelomeraseconsistsoftwoessentialcomponentstelomeraseRNAcomponentTERCandtelomerasereversetranscriptaseTERT,andCanprovidefunctionalRNAwhichselvesasatemplatetofinishtelomeresequencesynthesis.Telomeraseplayaimportantroleatthematainingoftelomerelengthandstability.Whenthelengthoftelomereshortenedatsomeextent.meexpressionoftelomeraseactivitywillbecomeconsequential.Somestudiesshowthatthelengthoftelomereingranulocytesofpatientswithaplasticanemia.【1Howeverthehematopoieticstemcellsofchildrenhaveahighpotentialityofmultiplication,andthetdomereshorteningisnotobviously.Sohowaboutoftheexpressionoftelomeraseactivityanditsrelatedgenesinthehematopoieticstemcellsofchildrenwithaplasticanemia,andweatheritwillbeaffectedwiththechangesoftelomerelength.Fortheaboveresons,wearegoingtocarryoutthisstudy.objeetiveTostudytheexploretheexpressionofhTERC,hTERTandtelomeraseacticityinmarrowhemopoieticstemcellsofchildrenwithAplasticAnemia,andexploretherelationshipsbetweenthem.Withclinicaldatas,toseeksomenewguidancesandtherapeuticmethodsforthepatientswithaplasticanemia.MaterialsandMethodsFifty.twochildrenwithchronicAA,13childrenwithacuteAAand21normalcontrolsfromtheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityandtheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversitywereenrollded.Allofthemwerewithoutanytreatment.TelomeraseacticitiesofthreegroupsweredetectedbyTelomericRepeatAmplificationProtocolTRAPwithsilverstaining,andtheexpressionofmRNAofhTERTandhTERCweredetectedbyrealtimeQPCR.TheresultswereanalyzedbySPSS17.0statisticsoftware,quantitatedateswereshowedNAbstractaSSc_ts,comparisonsbetweengroupswereanalyzedwithonefactoranalysisofvariance,comparisonsinonegroupusethewayofLSD,associationanalysisuselinearcorrelation,itwillhavestatisticalsignificancewhenP≤O.05.Results1.ExpressionleveloftelomeraseactivitythegroupwithCAAis41.35±10.28,thegroupwithSAAis31.8648.54.whicharesignificantlyhigherthanthecontrolgroup23.5049.13,andapproximatelytothecontrolgroup5.911.51,andtheCAAgroupshowstobesignificantly11igherthanSAAgroup.2.ExpressionlevelofhTERTmRNACAAgroup9.86t1.10andSAAgroup5.12±0.89,hadsignificantlyhighelexpressionsofhTERTmRNAthancontrolgroup1.17_0.73P0.01.3.ExpressionlevelofhTERCmRNAtherearenosignificantdifferencesamongCAAgroup1.23±O.50,SAAgroup1.1340.45,andcontrolgroup1.18±0.64e0.812.4.TherewasasignificantcorrelationbetweentheexpressionofhTERTmRNAandtelomeraseacticity产O.660.火0.01Conelusion1.Inmarrowhemopoieticstemcellsofchildrenwithaplasticanemia,bothtelomeraseacticityandtheexpressionofhTERTmRNAarehigherinchildrenwithAAthanthatin.normalones,thereisasignificantlypositivecorrelationbetweenthem.2.TheexpressionoftelomeraseacticitymaybeinvolvedinpathophysiologyanddevelopmentofAA,andhTERTplaysacrucialroleinexpressionoftelomeraseacticity.KeywordsaplsticanemiatelomerasemarrowhemopoieticstemcellchildrenVI目录正文部分中英文缩略词表.I端粒酶活性和相关基因在再障患儿骨髓造血干细胞中表达的研究1l引言..12材料与方法..63结果.154讨{念.165小结与展望2l6结论.227参考文献238附图27综述部分再生障碍性贫血中端粒和端粒酶的变化及治疗进展..29参考文献..41附录部分个人简历及在校期间发表的学术论文及成果..45致谢46

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