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骨髓增生异常综合征患者线粒体Mitoferrin12、ABCD10的表达与其铁超载的关系

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骨髓增生异常综合征患者线粒体Mitoferrin12、ABCD10的表达与其铁超载的关系

ATHESISSUBMITTEDTOZHENGZHOUUNIVERSITYFORTHEDEGREEOFMASTERTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN1/2ANDABCBIOANDRELATIONSHIPWITHMITOCHONDRIALIRONOVERLOADINMDSBYWEIBOXISUPERVISORPROF.YUFENGLIUPEDIATRICSTHEFIRSTCLINICALMEDICALCOLLEGEMAY2013原创性声明本人所呈交的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的,除了文中已经注明引用的内容外,本人的学位论文没有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为。对本文研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确的方式表明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名席做被2D侈年乡月J7H学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文矛BVE编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者廖缴爱.日期20L3M占月F7日摘要骨髓增生异常综合征患者线粒体MITOFERRIN一1/一2、ABCBL0的表达与其铁超载的关系研究生席微波导师刘玉峰郑州大学第一附属医院儿科河南郑州450052摘要研究目的通过对骨髓增生异常综合征MYELODYSPLASTICSYNDROMES,MDS患者MITOFERRIN.1、MITOFERRIN.2和ABCBIO在基因水平和蛋白水平的表达研究,揭示MDS患者线粒体铁超载的原因,探讨线粒体铁代谢异常在MDS发病中的作用,为祛铁治疗MDS提供依据。研究对象和方法1.选择MDS初诊患者成人23例和儿童8例为实验组,免疫性血小板减少症ITP初诊患者成人12例和儿童8例为本实验的近似健康对照组。实验组入选标准参照WHO2008MDS诊断分型,且要求未行输注红细胞和祛铁治疗;实验组和对照组均排除其它血液系统疾病、严重感染、甲状腺功能亢进等铁代谢异常的疾病。2.用无菌注射器分别抽取实验组和对照组的骨髓液,迅速涂片数张,后再抽取骨髓液各24ML,并迅速打入EDTA抗凝管中。3.分别抽取实验组和对照组清晨空腹静脉血各3ML,肝素抗凝,送至我院生化室检测血清铁代谢指标。4.分别对实验组和对照组骨髓细胞涂片行铁染色,光学显微镜下观察骨髓细胞摘要外铁、内铁的分布,记录并采集图像保存。5.应用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,并分装2管分别用于总RNA和蛋白的提取,于一80℃保存。6.参照TRIZOL试剂说明书提取骨髓单个核细胞中总RNA,检测RNA的纯度及完整性;应用FERMENTAS第一链反转录试剂盒合成CDNA;采用REAL.TIMEPCR测定MITOFERRIN.1MRNA、MITOFERRIN.2MRNA和ABCBL0MRNA的表达。7.使用RIPA裂解液提取骨髓单个核细胞中总蛋白,应用WESTERNBLOT分别测定MITOFERRIN一1、MITOFERRIN.2和ABCBL0蛋白的表达。结果1.成人MDS患者MITOFERRIN一1MRNA、MITOFERRIN.2MRNA和ABCBL0MRNA的表达与对照组比较均无明显统计学差异P0.05。2.1成人低危组即MDS.RA、MDS。RARS患者MITOFERRIN.1蛋白的表达高于对照组,差异有统计学意义P0.001;2高危组RAEB患者MITOFERRIN.1蛋白的表达与对照组比较,差异无统计学意义尸O.05;3RARS患者MITOFERRIN.1蛋白的表达高于RA,差异有统计学意义P0.0014MDS患者MITOFERRIN.2蛋白的表达与对照组比较,差异无统计学意义PO.05;5低危组ABCBL0蛋白的表达高于对照组,差异有统计学意义P0.001;6高危组ABCBL0蛋白的表达与对照组比较,差异无统计学意义尸0.05;7RARS患者ABCBL0蛋白的表达高于RA,差异有统计学意义P0.001。3.MDS患儿MITOFERRIN.1MRNA、MITOFERRIN.2MRNA和ABCBL0MRNA的表达与对照组比较均无明显统计学差异PO.05。4.12例RA患儿MITOFERRIN.1蛋白的表达均高于对照组;2RAEB患儿MITOFERRIN.1蛋白的表达与对照组相比,差异无统计学意义PO.05;3MDS患儿MITOFERRIN.2蛋白的表达与对照组相比,差异无统计学意义PO.05;42例RA患儿ABCBL0蛋白的表达均高于对照组;5RAEB患儿ABCBL0蛋白的表达与对照组相比,差异无统计学意义PO.05。结论1.MDS患者MITOFERRIN.1和ABCBL0在基因水平上的表达较对照均无明显增II摘要高,但在蛋白水平上的表达呈现出异质性,低危组RA、RARS表达高于对照组,高危组RAEB与对照组相比无明显增高。2.MDS患者MITOFERRIN.2在基因和蛋白水平上的表达较对照均无明显增高。3.MDS患者MITOFERRIN.1的表达可能受转录后的调节,在ABCBL0介导下不适当的稳定性的增加可能参与了部分MDS尤其是RARS患者线粒体铁超载的发生。4.MITOFERRIN.2可能与MDS线粒体铁超载的发生无关。关键词骨髓增生异常综合征;铁超载;线粒体;MITOFERRIN.1;MITOFEHIN一2;ABCBL0111ABSTRACT一一一THEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN1/一2ANDABCBL0ANDREIATIONSHIPWITHMITOCHONDRIALIRONOVERLOADINMDSPOSTGRADUATEWEIBOXISUPERVISORPROF.YUFENGLIUDEPARTMENT。FPEDIATRICS,THEFIRSTAFFILIATEDHOSPITALOFZHENGZHOUUNIVERSITYZHENGZHOU,HENAN,450052OBJECTIVEABSTRACTTHEAIMIST0STUDYTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN1,MITOFERRIN2ANDABCBL0ATTHEGENEANDPROTEINLEVELRESPECTIVELYINPATICNTSWITHMYELODYSPLASTICSYNDROMESMDS,INORDERTOREVEALTHEREASONSFORMITOCHONDRIALIRONOVERLOADINMDSPATIENTS,TOEXPLORETHEROLEOFMITOCHONDRIALIRONMETABOLISMABNORMALITIESINTHEPATHOGENESISOFMDS,ANDTOPROVIDETHEBASISFORIRONCHELATIONTHERAPYOBJECTANDMETHODS1.TOSELECTNEWLYDIAGNOSEDMDSPATIENTS23CASESOFADULTSAND8CASESOFCHILDREN、FORTHEEXPERIMENTALROUP,IMMUNETHROMBOCYTOPENIAITPOFNEWLYDIAGNOSEDPATIENTS12ADULTSAND8CHILDRENASTHESIMILARHEALTHYCONTROLGROUPOFTHISEXPERIMENT.THEINCLUSIONCRITERIAOFEXPERIMENTALGROUPREFEREDTOTHE2008WORLDHEALTHORGANIZATIONWHORECLASSIFICATIONOFMYELODYSPLASTLCSVNDROMESMDS.TOBEENROLLEDINTHISSTUDY,PATIENTSHADTOBEPREVIOUSLYUNTREATEDWITHREDBLOODCELLTRANSFUSIONSANDIRONCHELATINGAGENTS.THEEXPERIMENTALANDCONTROLGROUPWEREEXCLUDEDFROMOTHERBLOODDISEASES,SEVEREINFECTION,THYROIDHYPERFUNCTIONANDOTHERSWITHABNORMALIRONMETABOLISM2.TOEXTRACTBONEMARROWFLUIDFROM.THEEXPERIMENTALGROUPANDTHECONTROLGROUPIVABSTRACTWITHSTERILESYRINGE.SMEARAFEWPIECESQUICKLY,EXTRACTEACH2~4MLOFBONEMARROWFLUIDAGAINANDPUTINTOEDTAANTICOAGULANTTUBEFASTLY.EACH3MLOFFASTINGVENOUSBLOODWASEXTRACTEDFROMTHEEXPERIMENTALANDCONTROLGROUPINTHEEARLYMORNING,ANTICOAGULANTWITHHEPARINANDSENTTOTHEBIOCHEMISTRYDEPARTMENTOFOURHOSPITALTODETECTSERUMIRONMETABOLISMINDICATORS.BONEMARROWSMEARSOFTHEEXPERIMENTALANDCONTROLGROUPWEREDONEWITHIRONSTAININGRESPECTIVELY.TOOBSERVETHEDISTRIBUTIONSOFEXTRACELLULARIRONANDINTRACELLULARIRON,RECORDANDCAPTUREIMAGESTOSAVE.TOSEPARATEBONEMARROWMONONUCLEARCELLSBYDENSITYGRADIENTCENTRIFUGATION,DISTRIBUTEINTO2TUBESFORTHEEXTRACTIONOFTOTALRNAANDPROTEIN,ANDSTORETHEMAT一80℃.TOEXTRACTTHETOTALRNAFROMBONEMARROWMONONUCLEARCELLSWITHREFERENCETOTHETRIZOLREAGENTMANUAL,DETECTTHEPURITYANDINTEGRITYOFTHEEXTRACTEDRNA.TOSYNTHESIZETHECDNABYAPPLYINGFERMENTASFIRSTSTRANDREVERSETRANSCRIPTIONKIT.TODETECTTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN一1,MITOFERRIN一2ANDABCBL0MRNABYREAL.TIMEPCR.TOEXTRACTTHETOTALPROTEINFROMBONEMARROWMONONUCLEARCELLSUSINGRIPALYSISBUFFER.TODETECTTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN一1,MITOFERRIN一2ANDABCBL0PROTEINBYWESTERNBLOT.IKSUITSTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN一1MRNA,MITOFERRIN。2MRNAANDABCBL0MRNAINADULTMDSPATIENTSCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEPO.05.1,NLEEXPRESSIONOFMITOFERRIN1PROTEININADULTLOWRISKMDSRAANDRARSWASHIGHERTHANTHECONTROLGROUP,ANDTHEDIFFERENCEWASSTATISTICALLYSIGNIFICANT俨0.001;2THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN1PROTEININHIGHRISKMDSRAEBCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEPO.05;3THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN1PROTEININRARSWASHIGHERTHANV王龟孓ZABSTRACT4.RA,ANDTHEDIFFERENCEWASSTATISTICALLYSIGNIFICANTPO.001;4THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN一2PROTEININMDSPATIENTSCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEP0.05;5THEEXPRESSIONOFABCBL0PROTEININLOWRISKMDSWASHIGHERTHANTHECONTROLGROUP,ANDTHEDIFFERENCEWASSTATISTICALLYSIGNIFICANTPO.001;6THEEXPRESSIONOFABCBL0PROTEININHIGHRISKMDSCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCE俨0.05.7THEEXPRESSIONOFABCBL0PROTEININRARSWASHIGHERTHANRA,ANDTHEDIFFERENCEWASSTATISTICALLYSIGNIFICANTP0.001.THEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN一1MRNA,MITOFERRIN一2MRNAANDABCBL0MRNAINMDSCHILDRENCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEP0.05.1THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN1PROTEININ2CASESOFRACHILDRENWASHIGHERTHANTHECONTROLGROUP;2THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN一1PROTEININRAEBCHILDRENCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEPO.05;3THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN一2PROTEININMDSCHILDRENCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCEPO.05;4THEEXPRESSIONOFABCBL0PROTEININ2CASESOFRACHILDRENWASHIGHERTHANTHECONTROLGROUP;5THEEXPRESSIONOFABCBL0PROTEININRAEBCHILDRENCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPSHOWEDNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCE仔O.05.CONCLUSIONTHEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN1ANDABCBL0INMDSWERENOTSIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHECONTROLATTHEGENELEVEL.THEEXPRESSIONSOFMITOFERRIN一1ANDABCBL0INMDSSHOWEDHETEROGENEITYATTHEPROTEINLEVEL,HIGHERTHANTHECONTROLINLOWRISKGROUPRA,RARS,NOSIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHECONTROLINHIGHRISKGROUPRAEB.THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN2INMDSWASNOTSIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHECONTROLATBOTHGENEANDPROTEINLEVEL.THEEXPRESSIONOFMITOFERRIN1INMDSMAYBEREGULATEDBYPOSTTRANSCRIPTIONALVIL乙王ABSTRACIMECHANISM.THEINAPPROPRIATEINCREASEDSTABILIZATIONOFMITOFERRIN一1MEDIATEDBYABCBIOMAYBEINVOLVEDINTHEOCCURRENCEOFMITOCHONDRIALIRONOVERLOADINSOMEPATIENTSOFMDSESPECIALLYRARS.4.MITOFERRIN一2MAYNOTBERESPONSIBLEFORTHEOCCURRENCEOFMITOCHONDRIALIRONOVERLOADINMDS.KEYWORDSMYELODYSPLASTICSYNDROMES;IRONOVERLOAD;MITOCHONDRIA;MITOFERRIN一1;MITOFERRIN2ABCBIOVII

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