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过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Th1和Th2型免疫应答相关性研究

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过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Th1和Th2型免疫应答相关性研究

过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与THL和TH2型免疫应答相关性研究摘要目的探讨TLR2在过敏性紫癜患JLJB周血单核细胞的表达及其与TM和TH2型免疫应答的相关性,探讨TLR2在HSP发病机制的作用。方法选取2011年10月.2012年11月于我院收治的过敏性紫癜患儿64例为研究对象,分为HSP无肾损害组NHSPN,36例及HSP有肾损害组HSPN,28例,另选取我院儿保科健康查体儿童30例作为正常对照组。采用流式细胞术检测外周血单核细胞TLR2蛋白表达阳性率,实时荧光定量PCR技术检测外周血单核细胞TLR2.MRNA的基因相对表达量,ELISA法检测血浆IFN一小IL.4水平。两组间比较采用T检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSDT检验,相关分析采用PEARSON相关检验进行统计学处理。结果1.HSP患儿外周血单核细胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS,PBMCTLR2MRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均显著高于正常对照组T’4.283。P0.01;T75.487,P0.01,HSPN组外周血单核细胞TLR2MRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均明显高于NHSPN组F9.32,P0.05;F21.522,P0.01;2.HSP组血浆IL.4水平显著高于对照组T’13.446,P0.01,IFN.Y水平显著低于对照组T’14.364,P0.01,IVNV/M一4比值显著低于对照组T7.410,P0.01。3.HSP组CD4T细胞TLR2蛋白表达率TLR2MRNA呈正相关;与血浆IL.4水平呈显著正相关;与IFN.7/IL.4比值呈显著负相关;与血浆IFNY水平不存在相关性。结论1.HSP患儿外周血单核细胞TLR2MRNA及蛋白表达均明显增高;HSP有肾损害组患LCB周血单核细胞TLR2MRNA及蛋白表达皆显著高于HSP无肾损害组。2.HSP病儿存在THL/TH2失衡,TH2优势活化与TLR2蛋白表达升高呈显著相关。3.TLR2活化可能参与了HSP的免疫发病机制,TLR2的过度活化可能与HSP的肾损伤有关。。硕士研究生指导教师关键词过敏性紫癜;紫癜性肾炎;TOLL样受体;细胞介素.4IL.4程娜JH科学常红副教授7干扰素IFNY;白STUDYONTHEEXPRESSIONOFTLR2INPERIPHERALBLOODMONONUELEARCELLANDTHEBALANCEOFTHLFRH2INOFPATIENTSWITHHENOCHSCHNLEINPURPURAABSTRACTOBIECTIVEWESTUDYTHEEXPRESSIONOFTOLLLIKERECEPTOR2TLR2MRNAANDPROTEININPERIPHERALBLOODMONONUELEARCELLOFCHILDRENWITHHENOCHSCHONLEINPURPURAHSP,ANDTOEXPLOREITSINFLUENCEONTHL/TH2BALANCEINORDERTOINVESTIGATETHEROLESOFTLR2INTHEPATHOGENESISOFLISP.METHODS64CHILDRENWITHACLINICALDIAGNOSISOFHENOCHSCH6NLEINPURPURAWEREENROLLEDINTHESTUDYATPEDIATRICDEPARTMENTOFTHEAMLIATEDHOSPITALOFQINGDAOUNIVERSITYMEDICALCOLLEGEFROMOCTOBER2011TONOVEMBER2012,ALLPATIENTSHADACTIVEDISEASEATTHETIMEOFENROLLMENT,WHICHWEREDIVIDEDINTO2GROUPS,36C11ILDRENWITHNONHENOCHSCHONLEINPURPURANEPHRITISNHSPN,28CHILDRENWITHHENOCHSCHONLEINPURPURANEPHRITISHSPN。30HEALTHYAGEMATCHEDCHILDRENSERVEDASCONTROLSFROMC11ILDHEALTHDIVISIONOFTHISHOSPITAL.TLR2MRNARELATIVEOFEXPRESSIONLEVELONPERIPHERALBLOODMONONUELEARCELLSPBMCSWASDETECTEDBYREALTIMEFLUORESCENTPOLYMERASECHAINREACTION;TLR2PROTEINEXPRESSIONLEVELWASDETECTEDBYFLOWCYTOMETRICANALYSIS.THELEVELSOFIFNVANDIL一4INPLASMAWEREDETERMINEDBYELISA.WEUSEDONEWAYANALYSISOFVARIANCEANDPEARSONCORRELATIONTESTFORSTATISTICALANALYSIS.RESULTS1.COMPAREDWITLLTHECONTROLGROUP,THEEXPRESSIONLEVELOFTLR2MRNAWEREREMARKABLYINCREASEDINCHILDRENWITHHSP;THELEVELOFTLR2MRNAINHSPNGROUPWASHIGHERTHANTHATOFTHENHSPNGROUP.2.THELEVELSOFIFNYANDTHERATIOOFIFN一3/IL4INPLASMAOFHSPCHILDRENWERESIGNIFICANTLYLOWERTHANTHOSEOFTHECONTROLS,RESPECTIVELYWHILETHELEVELSOFIL一4WEREREMARKABLYHIGHERTHANTHOSEOFNORMALCHILDREN3.THEEXPRESSIONOFTLR2MRNAANDPROTEININPBMCSOFCHILDRENWITHHSPSHOWEDASIGNIFICANTPOSITIVECORRELATION.THETLR2PROTEINEXPRESSIONRATESOFCD4TINHSPCHILDRENHADPOSITIVECORRELATIONWIMTHEPLASMALEVELSOFIL4ANDNEGATIVECORRELATIONWITHTHERATIOOFIFN7/IL一4,BUTHADNOCORRELATIONWITHTHELEVELSOFIFNY.CONCLUSIONS1.INCHILDRENWITHHSP,THEEXPRESSIONLEVELSOFTLR2MRNAANDPROTEININPBMCSWEREREMARKABLYINCREASED;THEEXPRESSIONOFTLR2MRNAANDPROTEININPBMCSOFCHILDRENWITHHSPNSHOWEDSIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHATOFTHENHSPNGROUP;2THEREISAIMBALALICEOFTHL/TH2INHSPCHILDREN.ANDTHEFUNCTIONOFT112RELATIVELYPREVAILSOVERTH1.THEINCREASEOFTH2FUNCTIONSCORRELATESCLOSELYWITHHIGHEXPRESSIONOFTLR2OILPBMCS.3.THEABERRANTACTIVATIONOFTLI也MAYBECORRELATED、ⅣITLLIMMUNOLOGICALPATHOGENESISOFHSP,THEEXCESSIVEACTIVATIONOFTLR2MAYBEASSOCIATEDWITHRENALINJURYOFHSR4.THEACTIVATIONOFTLR2MAYMEDIATEIMMUDEPATHOGENESISOFLISPBYUPREGULATIONT112IMMULLERESPONSE.KEYWORDSHSP;HSPN;TLR2;IFN吖;IL一4POSTGRADUATESTUDENTCHENGNAPEDIATRICSDIRECTEDBYPROFCHANGHONG目录引言...1第一章材料与方法..31.1主要器材....31.2主要试剂....3L3引物...........31.4研究对象及分组....41.5研究方法....41.6统计学处理..9第二章结果.102.1血浆IFNY、IL4水平及IFNYIIL一4比值比较..102.2外周血单核细胞TLR2MRNA及蛋白表达变化.102.3HSP患儿外周血单核细胞TLR2MRNA与TLR2蛋白表达的相关性.1L2.4TLR2蛋白表达与血浆IFNY、IL一4水平及IFNY/IL一4比值的相关性分析.11第三章讨论.143.1HSP发病机制.143.2TLRS与免疫介导.143.3TLRS与相关疾病....153.3TLRS与HSP及HSPN.....16结论.18参考文献19综述.......22参考文献32攻读学位期间的研究成果.35致谢36学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明37引言过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与THL和TH2型免疫应答相关性研究引言过敏性紫癜HENOEHSCHONLEINPURPURA,HSP是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病,临床表现可累及皮肤、胃肠道、关节,肾脏等多个系统,肾脏受累的严重程度往往直接影响到本病的病程和预后。迄今其病因及发病机制尚未完全阐明。目前认为,感染为主要的发病诱因,发病机制主要为免疫功能紊乱,体液免疫异常表现为B细胞异常活化,导致大量免疫球蛋白增加,尤其是LGA的作用可能在HSP的发病过程中发挥了重要作用;细胞免疫异常主要表现有THL/TH2免疫应答失衡即THL功能降低,TH2优势活化,TH2类细胞因子中的IL一4、IL.5及IL.6明显增高,而THL类细胞因子IL.2及IFN一丫分泌减少。此PBT细胞功能改变、细胞因子和炎症介质、易感基因等因素在其发病中也起着重要作用。TOLL样受体TOLL.1IKERECEPTOR,TLRS蛋白家族是一种I型跨膜蛋白,通过识别病原微生物上的病原模式相关分子,激活细胞内的信号传导机制,最终产生一系列炎症细胞因子释放和启动适应性免疫应答,是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁【1】OTLRS主要表达在单核巨噬细胞、中性粒细胞、村突状细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞表面。根据TLRS的配体来源不同,我们将其分为外源性配体及内源性配体,外源性配体主要为病原微生物的共有成分,如细菌的脂多糖、脂蛋白、肽聚糖及核酸等;内源性的配体主要为宿主凋亡细胞或其裂解产物,如热休克蛋白、细胞外基质及细胞降解的成分等。不同的TLRS识别不同的配体TLR2主要识别细菌的脂蛋白;TLR3主要识别病毒RNA和人工合成RNA;TLR4可以识别细菌脂多糖、多种热休克蛋白、纤维蛋白原、肝素等12】。TLRS的信号途径分泌的细胞因子一方面可以介导炎症反应,使多种炎症细胞因子、趋化因子等表达上调,诱导或加重异常炎症反应,另一方面可以促使T细胞的分化及成熟。有研究发现TLRS可以调节THL、TH2型免疫应答,不同的TLRS表型、不同的TLRS的配体以及树突状细胞表面共刺激分子的差异,均可使TH细胞向不同的方向分化。FABIORE研究显示TLR2活化可以诱导TH2细胞的分化,TLR4途径可能与THL细胞的分化有关3“J。近年研究发现15ITLRS细胞信号转导在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮、川崎病等、炎症反应、超敏反应、细胞凋亡及移植排斥反应等疾病中有着非常重要的作用,TLRS信号通路还介导多种感染性和非感染性肾脏疾病,如尿路感染、病毒性相关性肾炎、IGA肾病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小病变性肾病等‘51。1青岛大学硕士学位论文但TLRS在HSP及HSPN的发病机制中的作用鲜有报道。本研究的目的为,通过检澳,OHSP患儿外周血单核细胞TLR2基因及蛋白表达和HSP患儿血浆中IL4、IFN7水平以及IFN一3/IL.4比值,以观察HSP病I,TLR2表达与辅助性T细胞亚群的功能之间的相关性,为进一步研究儿童HSP的发病机制及为HSP的治疗提供新思路。2第一章材料与方法第一章材料与方法1.1主要器材1SWCJ.1F型净化工作台苏州净化设备厂2LD52A型低速离心机北京医用离心机厂3925型超低温冰箱最低达.80℃美国FORMASCIENTIFIC公司4移液器法国EPPENDORF公司5凝胶成像仪北京赛智创业科技有限公司6电泳仪及电泳槽POWERSUPPLYPAC300B10一RAD7振荡器XH.DVORTEXMIXER8K5600超微量紫外分光光度计北京凯奥科技发展有限公司9低温合式高速冷冻离心机NEOFUGE13R型上海力申科学仪器有限公司10逆转录PCR机杭州博日有限公司11梯度PCR仪杭州博日有限公司12CYTOMICSFC500型流式细胞仪美国BECKMANCOULTER公司13微量离心机SIGMA1.13型SIGMA公司14制冰机AFIO型SCOTSMAN公司15微量电子天平BP3100S和BP21ID型SARTORIUS公司16立式灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司17550型酶标仪BIO.RAD公司F181575型洗板机BIO.M如公司1.2主要试剂1RPMI.1640培养液北京索莱宝生物技术有限公司2人淋巴细胞分离液北京索莱宝生物技术有限公司3RNAISOPLUS大连宝生物有限公司4RNAISOREAGENT总RNA提取试剂75%乙醇;三氯甲烷;异丙醇;超纯水;5琼脂糖AGAROSE;LOADINGBUFFER缓冲液6X溴酚兰50.500BPMARKER;GEL.REDEB;荧光定量反转录试剂盒DRR037A;两步法嵌合荧光RTPCR试剂盒,大连宝生生物公司6TIP头10UL、200UL、1000UL美亘AXYGEN公司71.5MLEP管、200ULPCR反应管美雪AXYGEN公司9磷酸盐缓冲液PHOSPHATEBUFFEREDSALINE,PBSEBIOSCIENCE公司10PE标记的抗人TLR4抗体及其同型对照PE标记的MOUSEIGG2A,KISOTYPE。3青岛大学硕士学位论文FITC标记的抗人CDL4抗体EBIOSCIENCE公司11IFNV、IL.4ELISA试剂盒上海森雄科技实业有限公司1.3引物根据GENEBANK中人的TLR2、GAPDH序列,选定目标片段,并由此设计合成引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列见表1。引物开盖前先短暂离心,加入DEPC处理的双蒸水稀释到浓度100UMOL/1,振荡混匀后置于.20。C的冰箱储存备用。表1TLR2及GAPHD的引物序列基因序列产物大小BP复性温度1.4研究对象及分组选取2011年11月至2012年11月在本院收治的过敏性紫癜急性发作期患JL64例作为研究对象,均符合1990年美国风湿病协会制定的HSP诊断标准。其中男性33例,女性31例,年龄在3.14岁之间,所有患儿均为首次发病,近4周内未使用任何糖皮质激素、免疫抑制剂或肝素等药物。根据2009年中华医学会儿科学分会肾脏病学组HSPN的诊治循证指南16】分为过敏性紫癜无’肾损害组NHSPN及过敏性紫癜有肾损害组HSPN。其中HSPN组共有28例,NHSPN组36例。另选取我院儿保科健康体检儿童30例作为正常对照组,其中男性17名,女性13名,年龄4.12岁。所有检查均获得受试者家属知情同意后实施,并报医院医学伦理会讨论通过。1.5研究方法1.5.1标本采集患儿入院后次日清晨无菌采取静脉血2.3MIAMI入无菌肝素抗凝管20IU/M1中,另取2M1力11入普通管中,室温下即刻予以进一步处理。1.5.2脐血单个核细胞CBMC的分离与培养采用密度梯度离心法。严格无菌操作,所有器皿均经高压蒸汽灭菌。1抗凝血中加入等体积RPMI.1640培养液稀释,混匀。2用吸管吸取稀释血液,在距淋巴细胞分离液面上约LCM处,沿管壁慢慢加入,以21比例将稀释血液悬浮于淋巴细胞分离液之上,室温下用低速离心机以2000RPM/MIN离一B12分钟。3离心完成后液体分四层,上层为血浆,第二层为白膜层即CBMC,第三4

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