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汉族儿童NKG2C基因缺失及体外Hpa、氯酸钠联合作用与HCMV感染的相关性研究

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汉族儿童NKG2C基因缺失及体外Hpa、氯酸钠联合作用与HCMV感染的相关性研究

分类号UDCR725.1615密级公珏编号鳇22曼QL曼Q丝JIANGSUUNLVERSITY硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION④论文题目这箧』L童巡鱼至二G基因筮去厘佳处№垒氢酸一铀联金佳且生塾G巡感染趁担差性研究学科专业』L型堂作者姓名..一苣垩娟指导教师.Q题纽废答辩日期三Q三生盍且Z∑目江苏大学硕士学位论文分类号BZ星墨LUDC615密级公珏编号Q星塑SQ圣Q星生硕士学位论文汉族儿童NKG2C基因缺失及体外IIPA、氯酸钠联合作用与TICMV感染的相关性研究INVESTIGATIONOFRELATIONSHIPBETWEENNKG2CDEFICIENCYINTHECHILDRENOFHANNATIONALITYANDHCMVINFECTIONANDINHIBITIVEEFFECTSOFHPACOMBINEDWITHNACL03ONHCMV作者姓名芦亚娟指导教师顾绍庆申请学位硕士学科专业儿科学答辩日期2013年06月08日学位授予单位江苏大学答辩委员会主席许文林教授基金资助江苏省自然科学基金资助项目基金编号BK2008238独创性声明IIIIIIIIELLIIIILIEIIILY2294391本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果,也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名钍硝少F;年6月『日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊光盘版电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致,允许论文被查阅和借阅,同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国学位论文全文数据库并向社会提供查询,授权中国学术期刊光盘版电子杂志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。论文的公布包括刊登授权江苏大学研究生院办理。本学位论文属于不保密D。学位论文作者签名芦里咱夕I1年‘月『日指导教师签名谤峻,F;年‘月『7EL江苏大学硕士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文全称HCⅣⅣHLADNAMHCNKNKRHCMVADT69HPATCIDSOHELFMTTDM匝MPBSTC50TD0CSRHSHSPGFQPCRGAGMAHUMANCYTOMEGALOVIRUS人巨细胞病毒HISTOCOMPATIBILITYLEUKOCYTEANTIGEN组织相容性白细胞抗原DEOXYRIBONUCLEICACID脱氧核糖核酸MAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX主要组织相容性复合体NATURALKILLER自然杀伤NKCELLRECEPTORNK细胞表面上的受体HUMANCYTOMEGALOVIRUSAD169STRAIN巨细胞病毒ADL69株HEPARANASE肝素酶50%TISSUECULTUREINECTIVEDOSE半数组织培养感染量HUMANEMBRYONICLUNGFIBROBLAST人胚肺成纤维细胞3一4,5DIMETHYLTHIAZOL2Y12,四甲基偶氮唑盐5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDEDULBECCO’SMODIFIEDEAGLESMEDIUM改良EAGLES培养液PHOSPHATE.BUEFFREDSALINE磷酸缓冲盐溶液MEDIANCYTOTOXICCONCENTRATION半数中毒浓度0%TOXICCONCENTRATION最大无毒浓度CELLSURVIVALRATE细胞存活率HEPARANSULFATE硫酸乙酰肝素HEPARANSULFATEPROTEOGLYCAN硫酸肝素糖蛋白FLUORESCENTQUANTITATIONPOLYMERASE.荧光定量聚合酶链反应CHAINREACTIONGLYCOSAMINOGLYCAN糖胺聚糖链IMMEDIATEEARLYANTIGEN前早期抗原江苏大学硕士学位论文目录中文摘要1ABS‘】F】;LAIIIT.....4第部分8前言81.J}JF料II2.I;躲F’LJ方I去.....123.结果164.讨J沧.........20参考文献.23第IS分.27前言.271.材料.292.LI.舱操F。II;方I去.....313.结果。354.’姚.........38参考文献40综J述........43攻读研究生期间发表的论文.52致谢53IH江苏大学硕士学位论文中文摘要第一部分汉族儿童N№2一C基因缺失与巨细胞病毒感染相关性研究目的本实验通过收集儿童血标本,用不同的检测方法检测外周血基因组中二有无NKG2C基因片段的缺失。确定儿童中NKG2.C基因片段的缺失率,并确定在临床上有感染人巨细胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS,HCMV明显症状的患儿,他们是否存在NKG2C缺失。为以后巨细胞病毒的诊断与治疗寻找新的方法提供理论基础。方祛在江苏大学附属人民医院收集104份患儿血液标本,将其分为巨细胞病毒感染组HCMV与非巨细胞病毒感染组HCMV。提取基因组DNA、设计引物、做普通PCR得到NKG2C的基因片段。用所获得的基因片段样本做琼脂糖凝胶电泳,通过紫外检测仪曝光检测有无相应基因长度的条带显示在琼脂糖胶上。筛选出缺失样本与带有NKG2一C基因的基因组样本作为对照为一组,已做过普通PCR后的NKG2.C基因片段样本为一组,两组都送基因测序公司测序。结果在HCMV组中患儿中NKG2.C纯合子缺失大约有4.16%。根据HARDYWEINBERG假设原理,计算出等位基因缺失概率约20.4%。在HCMV中患儿NKG2.C纯合子缺失大约有50%。两组相比,应用SPSSL6.0统计软件,采用卡方检验中Ⅵ呛S校正公式计算FL圾Z15.9,妒,,P0.005,得出两组NKG2C,PN口,基因片段的缺失相比差异是有明显统计学意义的结论。结论实验研究结果表明容易感染HCMV的儿童可能与其NKG2.C的缺失有关。本实验研究为以后巨细胞病毒的诊断与治疗都提供了理论依据。●江苏大学硕士学位论文第二部分肝素酶联合氯酸钠体外抗人巨细胞病毒的作用目的研究在体外用肝素酶与氯酸钠干预人胚肺成纤维细胞HUMANEMBRYONICLUNGFIBROBLAST,HELF,观察人巨细胞病毒感染干预HELF后的细胞病变,为证明细胞表面的硫酸乙酰肝素HEPARANSULFATE,HS与HCMV感染人胚胎成纤维细胞的吸附过程的关系。方I法1.测定HCMVADL69对HELF的毒力已长成单层HELF细胞培养板中加入1旷1107的HCMV病毒悬液,设正常细胞组为对照组,各组设8个复孔。当观察到细胞特征性病变效应CPE不再有变化时,记录出现CPE的孔数,按照REEDMUENCH法计算半数组织培养感染量TCD50。2.测定氯酸钠对HELF的毒性将不同浓度的氯酸钠分别加入已长成单层HELF细胞培养板中,设5个复孔,同时设不加氯酸钠的HELF为对照组。当倒置显微镜下观察到的细胞病变不再有变化约7天时,用MIT比色法测定每孔的A490值。计算细胞存活率CSR、半数中毒浓度TD50,推算出最大无毒浓度TDO。3.分组并进行荧光定量.PCR检测根据不同的干预方法分为细胞组A、病毒组B、氯酸钠组C、肝素酶组∞、联合用药组E。提取各组细胞内HCMVDNA,然后对其DNA提取液进行荧光定量.PCR检测。结果1.本实验测得的HCMV对HELF细胞半数感染量TCD50L酽Q0.1ML。2.氯酸钠的最大无毒浓度TDO为40MMOL/L。3.BE组HCMVDNA载量的均值分别为2.0735X106COPIES/50MG、6.4140X105COPIES/50MG、6.104X105COPIES/50MG、1.7370X103COPIES/50MG。B组与C组、B组与D组、C组与E组、D组与E组HCMVDNA拷贝数比较,差异有统计学意2江苏大学硕士学位论文义尸,D.酊。结论氯酸钠与肝素酶都有体外抗巨细胞病毒作用,联合用药比单独用药效果好。进一步证明了细胞表面的硫酸乙酰肝素与HCMV感染人胚胎成纤维细胞的吸附过程有一定的关系。关键词人巨细胞病毒;肝素酶;氯酸钠;硫酸乙酰肝素;NKG2.CNK细胞3

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