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黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞表达多种造血相关因子的干预研究

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黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞表达多种造血相关因子的干预研究

分类号密级UDC编号硕士学位论文黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞表达多种造血相关因子的干预研究研究生姓名谭艳芳指导教师姓名、职称殷小成副教授学科、专业名称儿科学研究方向小儿血液病学2013年4月1南华大学学位论文原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读(博/硕)士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有,本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定,即学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库,并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库,并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文,解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日2目录主要缩略语英文索引...............................................................................3中文摘要...................................................................................................4英文摘要...................................................................................................5前言...........................................................................................................7论文正文.................................................................................................111、材料与方法....................................................................................112、结果与分析...................................................................................183、讨论................................................................................................244、结论................................................................................................27参考文献.................................................................................................28综述.32发表文章.38致谢.393主要索略语英文索引缩略语英文全称中文译名MSCsbonemesenchymalstemcells骨髓间充质干细胞HSCHematopoieticstemcells造血干细胞DMEMLGDulbecosmodifiedeaglemedium低糖DMEM培养基lowGlucoseFBSFetalbovineserum胎牛血清MTT34,5diemthylthiahiazozy13,四甲偶氮唑盐5diphenytetrazoliumromideDMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸E.B.Ethidiumbromide溴化乙锭FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素GMCSFgranulocytemacrophagecolony粒细胞/巨噬细胞stimulatingfactor落刺激因子GCSFgranulocytecolonystimulatingfactor粒细胞集落刺激因子ILInterleukin白细胞介素SCFStemcellfactor干细胞因子TGFβ1Transforminggrowthfactor转化生长因子TPOThrombopoietin血小板生成素GVHDGraftversushostdisease移植物抗宿主病PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RTPCRReversetranscriptasepolymerase逆转录聚合酶链反应chainreactionSPSSstatisticalpackageofsocialscience社会科学统计软件包4黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞表达多种造血相关因子的干预研究研究生谭艳芳导师殷小成副教授中文摘要目的探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行方法,并鉴定生物学特性,为其进一步的分化研究及实际应用提供实验基础初步探讨黄芪甲甙对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)促增殖及分泌多种造血相关因子的影响,从而为黄芪甲甙在临床血液病中应用提供实验依据。方法取Wistar大鼠股骨、胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁筛选法和单克隆培养法分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs),在显微镜下观察其细胞形态学特点,并通过免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学特性。用四氮哇蓝比色法(MTT法)检测黄芪甲甙对MSCs增殖的影响,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测细胞因子的表达及黄芪甲甙对其表达细胞因子的影响。结果接种培养1224小时后,大部分细胞贴壁,随时间的延长,可见细胞集落式生长,呈成纤维细胞样,免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物CD44阳性率约为92.3%,CD45阳性率约为6.9。有干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、转化生长因子(TGFβ1)表达,不表达白介素3(IL3)加入不同浓度的黄芪甲甙与MSCs共培养24h、48h、72h后,以200mg/L黄芪甲甙组72h增殖作用最明显(P0.05)。结论1、通过全骨髓筛选贴壁法和单克隆培养法相结合成功地从大鼠骨髓分离到骨髓间充质干细胞,并能表达多种造血相关因子。2、黄芪甲甙能促进MSCs体外增殖,并可以诱导和促进MSCs分泌SCF,5这可能揭示了其促增殖和分化的部分作用机制。关键词骨髓间充质干细胞,黄芪甲甙,干细胞因子,RTPCR。6MultiplehematopoieticgrowthfactorssecretionbyratsboneMesenchymalstemcellsstimulatedwithAstragalosideIVAbstractObjectiveToexploreapracticalmethodofisolationandcultureoftheratMSCsinvitroandtoobservetheirlivingcharacteristicsandtoofferanexperimentalfoundationfortheirfurtherdifferentiationandactualapplication.TostudytheeffectofastragalosideIVontheexpressionofmultiplecytokinesbybonemesenchymalstemcells(MSCs)inrats.MethodsMSCswereisolatedfromadaltWistarratsandculturedbyusingthemethodofadhesivescreeningandclone,thendetectedthebiologicalactivitythecellsurfaceantigenofMSCswasdetectedwithimmunocytochemistry.ProliferationofMSCsstimulatedwithastragalosideIVwasascertainedbytheMTTmethod.ExpressionofhematopoieticgrowthfactorswasascertainedusingRTPCRinMSCswithastragalosideIVornot.ResultsTheisolatedMSCsofthemononuclearcellsofmarrow,mostlysubculturedcellsadheredthewallin1224h,presentedthecolonytypegrowth,exhibitingalargeexpansivepotentialandhighsuitability,atypicalfibroblastlikemorphology,and92.3%expressingCD44byimmunocytochemistry,only6.9%expressingCD45.MSCswereeffectivelyisolatedandpurifiedinvitro,andexpressedofmanyhematopoieticgrowthfactorsexceptIL3,suchasstemcellfactor(SCF),thrombopoietin(TPO),granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)andtransforminggrowthfactor(TGFβ1).AstragalosideIVstimulationpromotedMSCsproliferation,and200mg/LastragalosideIVtreatmentproducedapeakeffect72hafterculture.TheexpressionofSCFstimulatedwithastragalosideIVincreasedsignificantlycomparedwiththatinMSCswithoutastragalosideIVstimulation.ConclusionsMSCscouldbeeffectivelyisolatedandpurifiedbyusingthemethod7ofadhesivecultirationandclone,meanwhile,theycanexpressmanyhematopoieticgrowthfactors.AstragalosideIVmaypromoteMSCsproliferationandincreaseSCFsecretioninvitro.KeywordsMesenchymalstemcellsAstragalosideIVStemcellfactorReversetranscriptasepolymerasechainreaction.PostgraduateTanYanfangpediatricsDirectedbyProfessorYinXiaocheng8前言随着细胞和基因治疗技术和方法的发展,载体细胞或种子细胞逐渐成为影响细胞和基因治疗成功与否的关键环节之一。干细胞因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能已成为组织工程中首选的种子细胞。骨髓间充质干细胞来源充足,取材容易,移植后排斥反应弱,因此,成为细胞和基因治疗等方面研究的热点。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,MSCs)又称骨髓基质干细胞1、成纤维细胞集落形成单位2,是中胚层分化而成的一种非造血成体干细胞。在体外贴壁生长,适当的条件下可以大量扩增分化为脂肪、骨、软骨、血管内皮、成纤维细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等各种结缔组织细胞34,是组织工程中重要的种子细胞之一。有研究表明5MSCs可以调控和支持造血并对移植免疫有调节作用,主要是因其能分泌多种支持造血因子,表达多种细胞黏附分子,同时体外支持造血干细胞(HSC)扩增,与HSC联合移植可以体内促进HSC植入并重塑造血,已经成为继造血干细胞后第2个用于临床的干细胞,具有很重要的临床应用价值6。然而,在(0.1106)~(1.0106)个骨髓有核细胞中约含有1个MSCs,并且随着年龄的增加或体质的衰弱,细胞的数量逐渐减少7,因此要获得足量的MSCs,大量扩增纯化是十分必要的。造血微环境既能产生造血刺激因子,也能产生抑制因子8。MSCs是产生调控造血的细胞因子的主要来源。Chaudhary等9报道MSCs在体外培养诱导分化时表达多种造血细胞因子。近年来,干细胞的移植越来越受到人们的重视,而如何提高移植的成功率已成为国内外研究的热点,但解决问题的关键是提高造血干细胞的数量,针对这个问题最近又有了新的进展1011运用MSCs为基质细胞联合造血细胞因子体外培养扩增有核细胞、CD34、CD133,从而有效地解决造血干细胞的数量问题。综合国内外研究,扩增体系中最重要的细胞因子包括干细胞因子(SCF)、白介素(IL)3、酪氨酸激酶3类配基(FLT3Ligand)、血小板生成素(TPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。其中IL3、GMCSF为多系祖细胞刺激因子,主要刺激祖细胞的增殖和分化,而IL3能直接增加CD34细胞的绝对值12SCF和FLT3Ligand作用于干细胞和早期祖细胞的生长,是造血干细胞扩增的主要因子13TPO作用于晚期单向祖细胞,供进一步分化

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