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机械通气新生儿下气道细菌病原特点的研究

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机械通气新生儿下气道细菌病原特点的研究

机械通气新生儿下气道细菌病原特点的研究中文摘要目的1、通过对机械通气新生儿下气道分泌物分别行多重聚合酶链反应多重PCR与分离培养检测,以了解机械通气新生儿下气道常见细菌病原的特点同时比较多重PCR检测与分离培养此两种方法在临床应用中的优缺点,以期获得快速、敏感、恰当的病原体检测方法,指导抗生素的合理应用。2、探讨新生儿呼吸机相关性肺炎YAP的影响因素及早期应用美罗培南对呼吸机相关性肺炎的影响。方法1、收集青岛大学医学院附属医院新生儿科2012年7月到2012年12月行机械通气新生儿的下气道分泌物各2份,其中一份立即行分离培养和药敏检测。另一份.80℃冰箱保存,统一行多重PCR检测,根据新生儿呼吸机相关性肺炎常见病原菌,利用多重PCR方法检测5种常见细菌病原体金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌的阳性率及分布情况。同时回顾性分析同期青岛大学医学院附属医院所有科室全院住院病人中金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌及铜绿假单胞菌5种细菌病原的药敏感情况。2、回顾性分析2010年01月至2012年12月青岛大学医学院附属医院院新生儿科重症监护室NICU机械通气新生儿共106例的完整临床资料,分析机械通气新生儿的胎龄、出生体重、性别及机械通气时间与新生儿VAP的发生有无相关性及早期应用广谱抗生素对其预防作用。结果1.对75份下气道分泌物性多重PCR检测方法,5种新生儿VAP常见病原体的阳性率为28%,其中金黄色葡萄球菌2株,肺炎克雷白杆菌2株,大肠杆菌16株,鲍氏不动杆菌1株,铜绿假单胞菌0株行分离培养,共培养出9株病原体,其阳性率为12%,混合感染者1例,包括表皮葡萄球菌1株,肺炎克雷白杆菌2株,大肠杆菌1株,人苍白球杆菌1例,嗜麦芽单胞菌4。呼吸机相关性肺炎中较常见的5种细菌的药敏情况各异,金黄色葡萄球菌对青霉素类抗生素的耐药率达90%,对利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素等敏感率为100%。4种革兰氏阴性杆菌对青霉素类药物的耐药率达90%以上。肺炎克雷白杆菌和大肠杆菌对美罗培南、亚胺培南等碳氢酶烯类抗生素的敏感率较高,而鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌对其敏感率则较低。鲍氏不动杆菌仅对阿米卡星、舒普深和替加环素敏感性较高,铜绿假单胞菌对氨苄西林、三代头孢菌素除头孢他啶、复方新诺明、呋喃妥因的耐药率达97%以上,仅I删删对阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感性相对较高,分别为85.80%、89.90%。2.新生儿VAP的发生率为38.68%其中性别、胎龄、出生体重与新生儿VAP的发生无相关性P0.05,与机械通气时间呈正相关PO。05。早期应用美罗培南较应用耐酶青霉素使新生儿VAP的发生率明显下降X25.398,P0.02。结论1.多重PCR检测在下气道分泌物病原菌的确定中有重要的临床应用价值,其检测阳性率较分离培养高。2.多重PCR检测是分离培养的有利补充,增加检测菌株对临床的价值可能更大,阶段内院内药敏结果可作为临床抗生素选择的重要依据。3.机械通气时间的延长是VAP发生的高危因素,故应尽量缩短机械通气时间,以降低VAP的发生率。4.当高度怀疑新生儿VAP时,选用适合的抗菌药物有利于降低新生儿VAP的发生率。硕士研究生梁帅JL科学导师曲政海教授关键词多重PCR新生儿呼吸机相关性肺炎病原体相关因素ThepathogeniccharacteristicsofsecreationofthelowerrespiratorytractinthenewbornwithmechanicalventilationAbstactObjective1.ThroughusingthemutiplexPCRandculturetodetectthesecretionsofthelowerrespiratorytractfromthenewbonwithmechanicalventilation.tofindoutthenormalbacterialpathogens.andtoselectwhichmethodiSbeRerintheclinicaldiagnosis.Theaimistofindtherapid、sensitive、appropriatetestingmethodandtoguidetheapproptateantibiotics。2.ToinvestigatetheassociatedfactorsoftheventilatorassociatedpneumoniaVAPinthenewborn.Andtounderstandtheeffectofusingmeropenemattheearlierstageinthenewbomwith脚Methods1.Collectingthetwocopiesofsecretionsofthe10werrespiratorytractfromthenewbornwithmechanicalventilationintheneonatalintensivecareunitsNICUloftheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollegefromJuly2012toDecember2012.Oneofthecopywasculturedimmediately,andanotherwassavedinthestorage.80℃1。thenwasdetectedbymultiplexPCR.Tounderstandthepostiverateofthe5kindsofbactiralpathogensStaphylOCOCCUSaureus,klebsiellapneumoniae、E.coli、Acinetobacterbaumannii、PseudomonasaeruginosabymutiplexPCRdetection.Atthesametime.analysisofthesensibilityofantibioticsofthose5kindsofpathogensintheA伍liatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollegeatthesamestageretrospectively.2.ARetrospectivestudywasconductedin106newbornswithmechanicalventilationintheneonatalintensivecareunitsNICUloftheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollegefromJanuary2011toJune2012.Toanalysetherelationshipbeteeenthegender,thegestationalage、thebirthweightandthe脚Andtounderstandtheeffectofusingmeropenemattheearlierstageinthenewborn彤幼m1.Thepostiverateof75kindsofsecreationsinthelowerrespiratory仃actintheNewborniS28%bymultiplexPCR.includingStaphylococcusaureus2、kiebsiellapneumoniae2、E.coli16、Acinetobacterbaumannii1、Pseudomonasaeruginosa0.HowervertherateiS12%bytheculturemethod.and9kindsofpathogensweredetcetedandlpersonwasmixturedinfection,includingStaphlococcus1、klebsiellapneumoniae2、E.coli1、rencaibaiqiuganjun1,shimaiya4.Sensibilityanddrug.resistanceintheantibioticsaredifferentinthe5kindsbacteriapagethonswhichwerecommonwiththeVAP.ToStaphrlococcusaureus。therateofresistanceofpenicillinis90%.andthesentitiverateis100%inLinezolid、Teicoqlanin、Vancomycin.Thedrug.resistancerateinthepenicillinisabove90%inthe4kindsofgram.negativebacterias.TheklebsiellapneumoniaeandE.coliweresentivetoCarbapenemsmeropenem、imipenemeta1,butAcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosahadalowersentitiveness.Amikacin、SulperazonandtygacilarethedmgesofhighsentitivenesstoAcinetobacterbaumannii.Pseudomonasaemginosahadahighsentitivenesstoamikacin、TazobactamSodium/PiperacillinSodium,andtherateisrespectively85.80%、89.90%。2.Theincidenceof、7APis38.68%inNICU.Thegender、thegestationalageandthebirthweightwerenotrelatedtotheoccurrenceof幽Butthedevelopmentof脚wasnegativelycorrectedwiththedurationofmechanicalventilationrMY.Comparedwithpennicillin.theincidenceofVAPislowerinmeropenem.Conclusion1.MultiplexPCRwasimportantintheclinicalvalue,andtheposkiverateofmultiplePCRwashigherthantheculturetothesecretionsofthelowerrespiratorytractinthenewborn.2.111ecultureanddrugsusceptibilitycouldmakeupforthedisadvantagesofmultiplePCR.Andtheresultsofthedrugsusceptibilitywastheimportantbasistoselectthereasonableantibiotics.3.ThedurationofMViStheriskfactorofVAP.SOtoshortenthetimeofMVCanreducetheincidenceofVAP.4.Whenhappening啪highsuspectively,broadspectrumantibioticsisneededandatthesametimedetectingthepathogens.TheaimistodecreasetheincidenceofVAPinthenewbornPostgraduatestudentDirectedbyLiangShuaiPediatricsProfessorQuZhenghaiKeywordmultipelxPCR,ventilatorassociatedpneumonia,pathogen,associatedfactors目录引言1々I石l第一部分机械通气新生儿下气道细菌病原检测及药敏研究第一章材料与方法一21.1材料21.2病原体检测方法31.3统计学分析一4第二章结果52.1一般资料分析52.2对5种病原体性多重PCR检测结果52.3多重PCR检测结果与下气道分泌物培养检测结果比较52.4多重PCR检测在VAP诊断中的价值62.5全院住院病人中5种目标检测菌的药敏结果一62.6我院新生儿科4种目标检测菌的药敏结果8第三章讨论10第二部分新生儿呼吸机相关性肺炎相关因素分析第一章材料与方法131.1一般资料131.2机械通气指征及通气方法131.3治疗方法131.4VAP的诊断标准..131.5下气道分泌物的分离培养131.6统计学方法13第二章结果..142.1所有病例资料分析142.2新生儿VAP的发生率142.3新生儿VAP相关因素分析一152.4是否更换美罗培南对VAP发生率的影响152.5新生儿下气道分泌物的病原体检测16第三章讨论17结论20参考文献21综述参考文献33攻读学位期间的研究成果35致谢36学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属37引言引言随着围生期医学的不断发展与日渐成熟,新生儿尤其是早产儿、低出生体重儿的成活率较前明显升高。机械通气的应用在提高新生儿的存活率中起着不可替代的作用,而新生儿呼吸机相关性肺炎VAP也成为机械通气中最常见、最严重的并发症之一,其不仅延长了机械通气新生儿的住院时间,而且增加了病死率和住院费用。国内外文献曾报道新生儿VAP的发病率为28.3%一50%u书。。目前关于新生儿VAP的研究逐渐受到国内外重视,新生儿作为一个特殊的群体,其VAP发生的相关因素可归结为两方面一方面是外在因素即机械通气时气管插管、吸痰等刺激破坏气道防御屏障以及医护人员的不规范操作等另一方面是患儿机体内在因素,如早产儿、低出生体重儿等免疫功能未发育成熟且容易出现胃食管反流从而导致误吸入气道等情况。明确病原菌的类型在新生儿VAP的治疗中起着至关重要的作用。目前病原菌的分离培养仍是新生儿VAP病原学诊断的金标准,但是由于其费时,同时培养所需条件存在差异较大及抗生素早期不合理应用等因素的影响,使其阳性率较低,且容易出现假阳性或假阴性等结果,从而影响病原学的明确诊断,给临床的早期诊断与治疗带来不便。随着分子生物学技术的不断深入研究与完善,其在病原微生物的检测中得到广泛应用,尤其是PCR技术及其延伸技术如多重PCR、荧光定量PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR等,克服了分离培养、血清学检查等传统方法的缺点,成为灵敏度高、特异性强,省时、操作简单的诊断技术H1。正常人咽喉部有革兰氏阳性球菌定植,而长期住院的病人咽部定植菌主要为革兰氏阴性杆菌,且原发疾病越严重,革兰氏阴性杆菌的定植率越高,故NICU中新生儿VAP细菌感染主要以革兰氏阴性杆菌为主。由于抗生素不合理应用,新生儿VAP的病原菌多属耐药菌,给临床治疗及预后带来很大困扰。Fagon等【5】发现铜绿假单胞菌及大肠杆菌是新生儿VAP中最常见的病原体。常明等∞3曾报道VAP的常见病原体为革兰氏阴性杆菌占85.4%,前二位是肺炎克雷白杆菌和鲍氏不动杆菌,其中超广谱B一内酰胺酶ESBLs阳性菌占77.3%。本研究利用多重PCR检测新生儿VAP常见细菌病原体的分布,并与细菌分离培养进行比较,从而探讨多重PCR技术在临床应用中的价值,希望建立快速、特异性较强、敏感性较高的病原菌诊断方法,为临床早期的诊断与治疗提供依据同时回顾性分析同期我院该5种病原体的药敏情况,以指导临床上合理应用抗生素,减少抗生素的滥用,降低抗生素的耐药性并回顾性分析我院NICU中新生儿VAP的发生率、发生的相关因素及早期应用美罗培南对VAP的影响。第一部分第一章材料与方法第一部分机械通气新生儿下气道细菌病原检测及药敏研究第一章材料与方法1.1材料1.1.1研究对象收集2012年7月至2012年12月我院新生儿科重症监护室NICU行机械通气的患儿38例。男性患儿22例,女性患儿16例早产儿34例,足月儿4例。并回顾性分析我院同期所有住院病人中金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌及铜绿假单胞菌的药物敏感情况。1.1.2标本采集及保存将一次性无菌吸痰管连接灭菌密闭容器,经气管插管分别于机械通气48小时内、患儿病情变化及撤呼吸机时抽吸下气道分泌物共75份。将收集的下气道分泌物分成2份,一份于20分钟内送病原微生物室行分离培养与药敏检测另一份置.80。C冰箱保存,集中行多重PCR检测。1.1.3主要试剂、仪器及来源1主要试剂来源NaOH北京宝泰克生物科技有限公司注射用灭菌生理盐水北京宝泰克生物科技有限公司Tfis北京宝泰克生物科技有限公司EDTA北京宝泰克生物科技有限公司蛋白酶K北京康为世纪生物科技有限公司细菌DNA提取试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司无水乙醇北京宝泰克生物科技有限公司标准菌株青岛大学医学院附属医院病原微生物室PCR引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成TaqDNA聚合酶大连宝生物工程有限公司生产Loadingbuffer北京宝泰克生物科技有限公司Maker广州东盛生物科技有限公司琼脂糖美国Promega公司溴化乙锭北京宝泰克生物科技有限公司2主要仪器一次性痰杯江苏中国90mm平皿上海五一玻璃仪器厂中国摇菌箱DKZ2中国2青岛大学硕士学位论文细菌培养箱上海瑞丰仪器仪表有限公司中国超净工作台北京西城区半导体设备厂中国低温冰箱.80℃海信公司中国低温离心机Beckman美国核酸蛋白分析仪Beckman美国低温冰箱.20℃海信公司中国PCR仪Eppendoff,德国微波炉美的公司中国凝胶成像仪Albert德国1.2病原学检测方法1.2.1下气道分泌物分离培养与药敏检测1.2.1.1下气道分泌物的分离培养将获得的机械通气新生儿下气道分泌物取出后,将1/2行细菌分离培养,应用无菌接种环分别接种于哥伦比亚巧克力平板、哥伦比亚血平板和斯氏平板上,铺满90mm平皿,分别置于有氧、厌氧及二氧化碳环境下35。C,生长1872d,时,每隔18d,时记录一次,采用气袋法行厌氧菌培养,72d,时后观察并进行记录结果。按照全国临床检验操作规程的步骤与方法,对菌株行严格的培养与鉴定,且药敏的检测采用KB纸片扩散法,并按照美国临床实验标准委员会NCCLS标准进行结果判断。1.2.1.2药敏试验根据美国临床实验室标准化委员会NCCLS标准,对临床常用抗生素最低抑菌浓度MIC应用琼脂稀释法进行检测并记录。1.2.2下气道分泌物多重PeR检测1.2.2.1对照菌株选择5种呼吸机相关性肺炎常见细菌金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌的目标检测菌作为对照菌株。此5种菌株均有我院病原微生物室分离保存的菌株。1.2.2.2引物的设计根据GenBank基因序列,选择各致病菌特异性基因,且尽量使5对引物的退火温度较为接近,以便于统一反应条件。5种细菌的PCR引物序列详见表l

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