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嗜肝病毒大衣壳蛋白双重拓扑结构决定因子.doc

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嗜肝病毒大衣壳蛋白双重拓扑结构决定因子.doc

专业文档,值得下载专业文档,值得珍藏原文Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins作者CarstenLambert,SylviaMannandReinhildPrange作者单位DepartmentofMedicalMicrobiologyandHygiene,UniversityofMainz,Augustusplatz,D55101Mainz,Germany发表刊物JournalofGeneralVirology2004,85,1221–1225DOI10.1099/vir.0.197370以下为中文翻译稿嗜肝病毒大衣壳蛋白双重拓扑结构决定因子摘要为实现功能多样性,乙型肝炎病毒通过S结构域翻译过程中的膜整合和部分preS亚结构域翻译后的转移获得了双重跨膜拓扑结构。因为每个过程都需要第二个跨膜区域(thesecondtransmembranesegment,TM2,我们利用蛋白保护实验对L蛋白突变体进行分析,探讨该决定因子的行为。我们发现,亮氨酸拉链基序和TM2侧翼电荷均不影响L的拓扑学再定位。表型混合试验则表明在指引正确的L蛋白拓扑结构方面鸭HBVL蛋白的preS和S蛋白结构域不能代替HBV上的相应元件行使功能,因而两个嗜肝病毒属具有不同的转移机制。由于基因组较小,病毒都是利用尽可能小的多肽序列储存尽可能多的信息。因此,很多由病毒编码的蛋白和蛋白结构域都具有多种功能。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)(嗜肝病毒科Hepadnaviridae代表种),的大衣壳蛋白(L)即是其中的一个例子。该蛋白在病毒进入时作为受体蛋白起作用在病毒组装时,则是基质类似蛋白,同时还行使调节功能(Brussetal.,1996)。这种多功能性依赖于双重膜拓扑结构。该现象首先在嗜肝病毒L糖蛋白中被观察到Brussetal.,1994Ostapchuketal.,1994PrangeStreeck,1995GuoPugh,1997SwameyeSchaller,1997。最近,越来越多的证据表明,其他一些病毒衣壳蛋白也存在有两种或更多种拓扑异构结构行使多种不同的功能,如猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,TGE)的膜蛋白(Escorsetal.,2001)、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)E1和E2衣壳蛋白亚结构域(Cocquereletal.,2002)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)融合蛋白McGinnesetal.,2003等。到目前为止,对于HBVL蛋白双重拓扑结构的形成机制仍然了解不多。L蛋白、中(M)和小(S)衣壳蛋白由一个开放阅读框从不同位点起始翻译表达而来。因此,S蛋白序列在含preS2结构域的M蛋白和含preS2和preS1结构域的L蛋白的C端得到重复(HeermannGerlich,1991。这三个蛋白都在翻译过程中整合到内质网(endoplasmicreticulum,ER)膜上,该过程很可能由第一和第二个跨膜transmembrane,TM节段(TM1和TM2)上的信号锚定和转移停止序列所向导Ebleetal.,1987。这些信号也将M蛋白preS2上游区域在翻译时导向内质网腔Ebleetal.,1990。与此相反,L蛋白preS2和preS1(preS)结构域开始时专业文档,值得下载专业文档,值得珍藏都停留在细胞质中。成熟过程中,大约一半的L蛋白将preS结构域翻译后转移至内质网,从而产生病毒衣壳内的双重拓扑结构Brussetal.,1994Fig.1。通过将preS结构域定位于胞质(病毒内)和管腔(病毒外),L蛋白在病毒生活周期中行使两种截然不同的功能病毒衣壳和结合受体。我们以前的研究表明在病毒组装过程中,部分HBVpreS的翻译后转移似乎并不通过由衣壳蛋白跨膜区横向相互作用所产生的特异性通道,因为该过程既不需要S和M蛋白,也不需要任何参与通道形成的双性跨膜区域(LambertPrange,2001)。更确切地说L蛋白拓扑学再定位与宿主细胞跨膜运输机制有关,因为我们发现它与ER膜相关。这些研究同时表明TM2是preS翻译后转移的一个关键决定因子。第二决定因子则指向L蛋白preS1结构域内部的一个特殊结构域。Fig.1.HBVL衣壳蛋白结构域和跨膜拓扑学结构示意图。AL蛋白结构域示意图。数字代表氨基酸位置白框代表四个跨膜结构域,前两个分别为1和2¥代表Asn309上的N连接糖基化。BL在内质网上的拓扑学模型。开始随着翻译过程中的膜整合,preS位于ER的胞质面(左)成熟过程中,约50L蛋白的preS在翻译后转移至内质网腔(右)。C瞬时转染COS7细胞表达的HAtaggedL蛋白的胰蛋白酶保护实验分析。转染两天后,准备微粒体,进行胰蛋白酶和NP40存在与否的交叉处理,样品通过HA特异性免疫印迹进行检测分析。L蛋白的糖基化gp42和非糖基化p39形式以及胰蛋白酶处理后的非糖基化T和单糖基化gT片段图中都有标示。此实验中,S和M蛋白的合成通过起始密码子的错义突变被抑制。该结构域被称为胞质锚定因子(cytosolicanchoragedeterminant,CAD),它能与同源热休克蛋白(heatshockprotein,Hsc70)相互作用,而阻止翻译过程中pre–S的转移LöfflerMaryetal.,1997LambertPrange,2003。两个拓扑学决定子都在相同的L分子中发挥顺式作用。这与DHBVL同源物不同。DHBVL同源物采用相同的双重拓扑结构,但限制preS特异决定子,如一系列赖氨酸残基和Hsc70结合因子,作为顺式元件起作用,而共表达S链所提供的S特异决定子,如TM1,则是作为反式因子起作用SwameyeSchaller,1997Grgacic,2002。两者更大的差异还在于DHBVL蛋白拓扑结构的转换与衣壳形态发生和输出相一致Grgacic,2002。总之,这些现象都说明这两种嗜肝病毒L蛋白虽具有相同的表型,但其折叠方式却背道而驰。本文将集中关注HBVL蛋白重定位过程中的拓扑学决定子以及它们的分子特性、功能和对蛋白定向的影响。我们构建了一系列蛋白突变体并通过COS–7细胞中的瞬时表达对其拓扑学特征进行分析。另外,微粒体的胰蛋白酶保护实验也被用于检测部分L蛋白preS翻译后的跨膜分布LambertPrange,2001。当L蛋白在PNI2.LHA质粒中,以HAtag融合进行表达时,该蛋白将以成对形式出现39kDa的非糖基化蛋白p39和42kDa单糖基化蛋白gp42(S结构域Asn–309被部分N糖基化的结果)。新合成的L蛋白的pre–S区域对胰蛋白酶的切割非常敏感。但随着时间迁移,部分L蛋白翻译后转移至ER,而对胰蛋白酶的切割产生保护,有达50–60的L蛋白对胰专业文档,值得下载专业文档,值得珍藏蛋白酶有抗性而处于稳定状态(Fig.1)。因此,去污剂(NP–40)不存在时,胰蛋白酶的处理将L蛋白分成两部分一部分L蛋白的pre–S翻译后定位于ER,对胰蛋白酶具抗性,而以全长分子形式存在另一部分L蛋白pre–S转移至细胞质,对胰白酶敏感,从而被切割为非糖基化的25kDa片段(T)和对应于C端S区域,被单糖基化的28kDa片段(gT)。当微粒体用NP–40崩解后,L蛋白都被切割成T和gT两个片段。pre–S蛋白的翻译后再定位模式已被含两个竞争性糖基化位点Asn–4和Asn–123的pre–S不能被N连接糖基化的事实所证实(Löffler–Maryetal.,1997)。我们以前的研究表明,在L蛋白的四个跨膜区域中,只有TM2是pre–S翻译后转移所需要的(LambertPrange,2001)。尽管这些结果很大程度上排除了HBV特殊衣壳结构作为pre–S通道的可能性,但仍有可能TM2结构域通过helicalpacking的横向相互作用形成自主转移通道。由此通过数据分析,我们在TM2中找到了一个可能具自身相互作用并能形成孔道结构的亮氨酸富含区Gurezkaetal.,1999Scholzeetal.,2002。为了确认这个由Leu–247,Leu–254和Leu–261组成的亮氨酸拉链基序是否与Pre–S重新定位有关,我们通过PCR方法构建了一些双重或三重丙氨酸替代突变体。L247/254A、L247/261A、L254/261和L247/254/261A突变体在COS–7细胞中表达时,其产物和野生型L蛋白一样均成对出现,并在翻译过程中插入内质网膜Fig.2A。拓扑结构分析显示所有双重突变体都具野生型的转移特征在没有NP–40时,40–50的多肽受微粒体膜的保护而不被胰蛋白酶切割。三重突变体使pre–S在更大程度上表现出翻译后转移特性。因此,亮氨酸拉链基序不为pre–S翻译后转移所需,但似乎影响其程度。Fig.2.TM2在L蛋白preS翻译后转移过程中的作用。A亮氨酸拉链基序不为preS的翻译后转移所依赖。左图中亮氨酸拉链基序的氨基酸被展示,亮氨酸用黑体标示,数字表示亮氨酸的氨基酸位置右图为HA融合的L突变体转染COS7细胞后的胰蛋白酶切割实验分析。L蛋白非糖基形式p39和单糖基化形式gp42的位置如图。BTM2侧翼极性氨基酸不为preS的翻译后转移所依赖。在左图,TM2侧翼极性氨基酸R236,R241,R242andD262用黑体所标示右图表示突变体的拓扑学结构分析(胰蛋白酶切割试验)。突变体以替代氨基酸命名。p39和gp42已被表示。TM2的另一显著特点是邻近电荷的不对称分布,包括前面的三个精氨酸和后面紧接的一个天冬氨酸。根据对跨膜结构域两侧极性残基功能的了解(BoydBeckwith,1990),这些电荷似乎对TM2的停止转移功能很重要,另外它们的极性侧链可能参与螺旋间氢键以及跨膜螺旋相互作用(Vbarretxena–BelandiaEngelman,2001)在L链间形成蛋白与蛋白接合界面,使pre–S在翻译后转移。我专业文档,值得下载专业文档,值得珍藏们将Arg–236,Arg–241,Arg–242和Asp–262依次突变成不带电残基,如丙氨酸和亮氨酸,以检验它们对L重折叠的影响。蛋白保护实验显示R236L,R242A和D262A突变体均能形成正确的L拓扑结构,表现为在完整微粒体中对胰蛋白酶切割有部分抗性,缺乏preS耦联的N聚糖Fig.2B,而R241A突变体能更高水平地在翻译后转移pre–S。也许这种替代会导致结构上更大程度地失去对转移的控制,从而改变定位于管腔内的pre–S与定位于细胞质的pre–S间的平衡。综合这些数据表明L蛋白翻译后的重新定位不依赖TM2上可能的跨膜helix–helixpacking基序、亮氨酸拉链基序、极性氨基酸,进而揭示L重折叠与衣壳组装无关。Fig.3.DHBV衣壳蛋白亚基不能功能性取代HBVpreSandS结构域。A,BpreShSdandpreSdSh嵌合体示意图。ApreShSdHBVpreS结构域与DHBVS结构域融合BpreSdShDHBVpreS结构域与HBVS结构域融合.图中数字代表氨基酸的位置。为分析N连接低聚糖,细胞裂解物分为两部分一部分不处理lane1,另一部分用PNGaseF消化lane2。拓扑学分析则继续采用胰蛋白酶消化试验。蛋白通过SDSPAGE和HA特异性免疫印迹进行分析。非糖基化p和糖基化gp,ggp形式产物用箭头标示。右边的数字代表标准分子量(kDa)。为了更深入的了解L蛋白的拓扑学行为,我们进行了结构域交换实验对哺乳类和禽类HBV衣壳蛋白亚结构域进行洗牌。首先我们用DHBVS区域取代HBVL蛋白S区域,构建preShSd嵌合体(DHBVS区域扩增自质粒pDHBVWildneretal.,1991。与预期的一致,preShSh表达形成37KDa的膜结合蛋白Fig.3A。令人惊讶的是,另外还有两个高分子量蛋白。在用NglycosidaseF(PNGaseF)去糖基化后这些条带消失,表明它们被N连接糖基化。因为DHBVS结构域不含N聚糖,preshSd的修饰只可能发生在preS的Asn–4和Asn123。又因preShSd的这些糖基化位点位于内质网膜的管腔一侧,这些现象揭示令人惊讶的preS边翻译边转移的模式。与此相一致的是,大多数(~95)糖基化的preShSd链在完整的微粒体中具胰蛋白酶抗性,而非糖基化的P37则对胰蛋白酶敏感。这可能性是因为共翻译的preS不能有效的运至内质网和/或preS从内质网中倒退出来。相似结果但不同的转移途径在DHBVpreS和HBVS嵌合体preSdSh中表现出来。PNGaseF消化处理也证实preSdSh具糖基化和非糖基化两种形式(Fig.3B)。极可能发生在HBVS结构域Asn309上的N连接糖基化,揭示

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