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抗菌肽抗菌机制及其应用研究进展.doc

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抗菌肽抗菌机制及其应用研究进展.doc

专业文档,值得下载专业文档,值得珍藏抗菌肽抗菌机制及其应用研究进展王兴顺1耿艺介2杨冬燕2李文楚1邓平建2(1.华南农业大学动物科学学院,广州5106422..深圳市疾病预防控制中心,深圳518055)摘要抗菌肽是一类小分子肽,具有广谱的抗菌活性。关于抗菌肽抗菌机理的研究以往主要集中在抗菌肽对细菌细胞膜的作用上,包含桶板模型,毯式模型,环形孔模型,凝聚模型。近年来相继发现某些抗菌肽可以作用于细菌细胞内部,与核酸物质结合,阻断DNA复制、RNA合成影响蛋白质合成抑制隔膜、细胞壁合成,阻碍细胞分裂抑制胞内酶的活性。本文从胞内机制和胞外机制两个角度对抗菌肽的抗菌机制进行综述,以期阐明各类抗菌肽的作用机理,为进一步研究菌株耐药性、昆虫抗菌肽对耐药菌株的杀菌效果及其杀菌机制提供科学根据。关键词抗菌肽昆虫抗菌活性胞内机制胞外机制AdvancedResearchesinAntibacterialMechanismsofAntimicrobialPeptidesandtheirApplicationStudiesWANGXingShun1,GENGYiJie2,YANGDongYan2,LIWenChu1,DENGPinJian2,1CollegeofAnimalScience,.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China2.ShenzhenCenterforDiseaseControlandprevention,Shenzhen518055,ChinaAbstractAntimicrobialpeptidesaresmallpeptideswithbroadspectrumantibacterialactivity.Abouttheantibacterialmechanismofantimicrobialpeptidesmainlyconcentratedonthefunctionofthecellmembraneofbacteria,includingBarrelstavemodel,Carpetmodel,ToroidalporemodelandAggregatemodelinthepast.SomeantimicrobialpeptideshavebeenfoundrecentlythattheycouldcombinewithnucleicacidmaterialblockDNAandRNAreplicationaffectproteinsynthesisrestrainthediaphragmcellwallsynthesis,blockcelldivisioninhibitenzymaticactivityinthecellsofbacteriainside.Toelucidateantibacterialmechanismsofvariousantibacterialpeptide,bothintracellularandextracellularantibacterialmechanismsforantimicrobialpeptideswerediscussedinthepaper.Itwouldprovidescientificbasisforfurtherstudiesoninhibiteffectsofinsectantibacterialpeptidesagainstdrugresistancebacterialstrainandtheirmechanisms.KeywordsantimicrobialpeptidesinsectantibacterialactivityIntracellularmechanismsextracellularmechanisms抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是指有机体在真核生物的核糖体和原核生物非核糖体合成的小分子碱性多肽。如昆虫抗菌肽、杆菌肽、多粘菌素等(马文山等,2008)。2其中昆虫抗菌物质种类繁多,品种多样,分布广泛(李文楚,2000)。昆虫体内最早纯化的可诱导性抗菌肽是天蚕素Cecropins,是由瑞典科学家Boman等(1972)在惜古比天蚕Hyalophoracecropia体内注射E.coliK12D31诱导产生并命名。黄自然等(1981,1987),用柞蚕蛹注射大肠杆菌诱导产生抗菌肽,并发现其具有杀菌谱广,耐热等基本特性。此后数年间,人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得1000了多种具有抗菌活性的多肽。AMPs具有广谱抗菌作用,其对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用,还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞却不破坏动物体内的正常细胞,是一类极具潜力的肽类抗生素Dourado等,2007。抗菌肽在快速杀菌的同时,还具有不易产生耐药性,不会导致脓毒症,同时中和内毒素等特性(马清泉等,2011)。目前已经成为各国抗菌领域的研究热点。根据结构可将抗菌肽分为1单链无半胱氨酸残基的α螺旋,或由无规卷曲连接的两段α螺旋组成的肽2富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽3含1个二硫键的抗菌多肽4有2个或2个以上二硫键、具有β折叠结构的抗菌肽5由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽(Bell等,2011)。按抗菌肽产生的来源又可分为(1)昆虫抗菌肽,鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、膜翅目、蜻蜓目等多种昆虫都能诱导产生各种抗菌肽,包括天蚕素类和昆虫防御素等(李文楚,2000)(2)植物源抗菌肽,是植物自身合成的能够防御环境中微生物侵害的一类小分子多肽。包括硫素、植物防御素、脂转移蛋白、橡胶蛋白类、打结素类、凤仙花素等3鱼类抗菌肽,是鱼体天然免疫的重要组成部分,是一类小分子蛋白质,其结构与组成复杂多样4哺乳动物抗菌肽,在吞噬细胞和黏膜上皮细胞表达,主要有3类,分别是防御素、cathelicidins和histatins(5)两栖类来源的抗菌肽,如蛙皮肽。(6)微生物源抗菌肽,如Nisin抗菌肽,多黏菌素,杆菌肽等。各种结构和来源的抗菌肽已经在医药,农业,畜牧等技术领域得到了成功的应用。由于常用抗生素抗药性的日益增长,新抗生素的开发利用引起人们浓厚的兴趣。在开发利用动物源抗菌肽直接用于临床的药物中,有局部给药、口服药和系统给药的各种产品(Zasloff,2002)。通过植物转基因技术,已经成功地获得了一些抗病品种,如转基因烟草DeGray等,2001黄自然等,1992)、番茄、辣椒(刘清神等,2005)、桑树等。由于抗生素的应用引起抗药性的矛盾日益尖锐,耐药超级菌引发民众恐慌,欧盟更禁止使用抗生素,销往欧盟的各种饲料添加剂必须经过抗生素检测,越来越多的厂家选择安全无毒的抗菌肽等作为饲料添3加剂,因此,抗菌肽在饲料加工业的应用前景广阔。关于抗菌肽的作用机制也引起了广泛的关注。1981年以来,国内外已有很多关于抗菌肽活性机理研究报道,但是目前还没有任何一种单一理论可对抗菌肽的活性机理给出充分的解释。已用于研究其活性机理的方法主要有显微镜技术、膜模型方法、荧光染色技术、离子通道技术、圆二色谱技术、固态核磁共振分析技术等(Orioni,2009LópezOyama,2011Yoneyama,2009)目前,国内外从事抗菌肽研究的科研队伍非常强大,各种抗菌肽研究进展的文献众多。本文在查阅大量抗菌肽文献资料的基础上,试图从昆虫抗菌肽杀菌机制方面进行概述,了解国内外的研究前沿,提炼其研究和应用重点,为进一步研究菌株耐药性、昆虫抗菌肽对耐药菌株的杀菌效果及其杀菌机制提供科学根据。1.抗菌肽胞外杀菌作用机制抗菌肽胞外杀菌机制主要是作用于细菌细胞膜,抗菌肽的脂水两亲性结构能够选择性的结合于细菌细胞膜形成膜孔道,破坏其胞膜完整性、发挥杀菌作用。革兰氏阳性菌胞膜上的磷壁酸和革兰氏阴性菌胞膜上的脂多糖均带有负电荷。当阳离子抗菌肽靠近细菌胞膜时,抗菌肽能竞争性地取代膜表面上的二价阳离子Mg2或Ca2,与磷壁酸或脂多糖之间形成静电引力,进而贴附到细菌胞膜上(Khandelia等,2008)。在抗菌肽与细菌胞膜的相互作用下,肽的疏水部分与胞膜磷脂的疏水头基结合形成肽脂超分子复合物并插入到胞膜中,而肽的亲水部分与胞膜脂质结合构成通道周壁,形成跨细菌胞膜的通道。多数抗菌肽杀菌作用的基本机制就是通过形成这种跨膜通道破坏细菌胞膜的完整性,导致细胞内容物大量外流、胞外水分大量内流,使细胞内渗透压发生改变,最后细菌失去保护而死亡(Hale等,2007)。目前,研究发现了四种胞膜渗透作用的模型。1.1桶板模型(Barrelstavemodel)桶板模型是Ehrenstein和Lecar早在1977年提出,而抗菌肽作用于细胞膜的作用方式由Oren等(1998)给出解说。即结合于细胞膜表面的抗菌肽相互聚合,以多聚体形式插入细胞膜双分子层中,形成横跨细胞膜的离子通道。离子通道形成后外界的水分可渗入细胞内部,细胞质也可渗透到外部。由于失去能量,严重时细胞膜就会崩解而导致细胞死亡。这个模型有三个特征1)抗菌肽在垂直细胞膜的方向上形成孔或渠道,2)膜脂不会镶嵌在孔道里,也不会结合到抗菌肽上,3)所形成的孔道是一个明确的动态结构(黄亦兵等,2010)。采用桶板模型机制发挥作用的抗菌肽,一般包含两亲性的α螺旋,疏水性的α螺旋、β折叠片层的结构,或同时含有这些结构。抗菌肽LS3是人工合成的两亲性的α螺旋肽,是由4疏水的亮氨酸(L)和亲水的丝氨酸(S)组成的21个残基肽(LSSLLSL)。Gkeka和Sarkisov(2009)对抗菌肽LS3与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC脂双层相互作用的研究中进一步探讨了木桶模型中孔道的形成机理。研究结果显示,在跨膜形成的木桶状毛孔是由内径约5.2Å的跨膜螺旋肽组成,而每个孔道又由6个α螺旋肽组装而成,组装过程中极性的亲水残基丝氨酸(S)在孔道内部,而非极性的疏水残基亮氨酸(L)则在孔道外侧,这个过程主要运用膜电位,因为螺旋内部N端带正电,C端带负电,使电荷不均匀地分布在孔道内以增加孔道稳定。桶板模型确认了抗菌肽的两亲性结构,即亲水性和疏水性的α螺旋,但很明显不支持膜脂双层结构与抗菌肽的结合学说,垂直方向孔道的形成若没有疏水端在膜上的锚定就还有值得深入研究的机制。1.2毯式模型(Carpetmodel)毯式模型是由Pouny等人(1992)提出的,即抗菌肽平行于细胞膜排列,如同一张地毯覆盖于磷脂膜外表面。与其他模型一样,阳离子抗菌肽通过静电作用结合到细胞膜,覆盖在磷脂双层上。当抗菌肽浓度达到临界值时,被覆盖区域的细胞膜因稳定性降低而出现显著的弯曲从而破裂,此过程中不形成通道。以毯式模型发挥作用的抗菌肽分子多含有β折叠结构。从蛾血淋巴中提取的抗菌肽cecropinP1,采用偏光衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATRFTIR技术)对cecropinP1的研究发现,这种肽最初不进入疏水环境而是平贴在细胞膜表面,从而形成不稳定的磷脂胞膜,导致膜破坏。Orioni等(2009)的研究小组采用荧光光谱和分子动力学技术模拟抗菌肽PMAP23的研究结果支持了毯式模型的理论。LópezOyama等(2011)对阳离子抗菌肽bactenecin与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC脂双层,及十四酰磷脂酸(DMPG)间相互作用的研究探讨毯式模型的形成机理。肽吸附在DPPC上的过程,在显微镜下显示为DMPG聚集组装肽,形成类似地毯形状的长丝状网格,以形成孔状结构。毯式模型属于β折叠结构占主导的抗菌肽作用模式,显然是由β折叠结构特征所决定,长丝状网格是β折叠中的活性分子与膜相互作用的结果。这种模型并不适用于α螺旋为主的昆虫抗菌肽cecropin,因为电镜下观察到内容物泻出的瞬间,菌体并未崩溃,应该是通道形成造成的。1.3环形孔(虫孔)模型(Toroidalporemodel)环形孔模型是由Matsuzaki等(1995,1996)提出的,该模型即抗菌肽与细胞膜表面结合后,其疏水区的移位可使细胞膜疏水中心形成裂口,并引发磷脂单分子层向内弯曲,直至孔道形成。与桶板模型不同之处在于抗菌肽始终与磷脂膜头部相结合,两者共同形成跨膜孔道。细菌素乳酸乳球菌曲5LactococcuslactisQU5产生的抗菌肽LacticinQ的抗菌机

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