广西地方标准《山羊支原体肺炎防控技术规程》征求意见稿

ICS11220B41DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXXXXXX山羊支原体肺炎防控技术规程PREVENTIONANDCONTROLTECHNOLOGYSTANDARDFORCAPRINEMYCOPLASMALPNEUMONIA（征求意见稿）XXXXXXXX发布XXXXXXXX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXXXXXXI目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14环境质量及卫生控制15管理措施16诊断27防治措施38无害化处理4附录A（规范性附录）特异性引物序列及检测结果凝胶电泳图示6附录B（规范性附录）微量间接血凝试验8附录C（规范性附录）溴化乙锭溶液及废弃溴化乙锭接触物的净化处理10DB45/TXXXXXXXXXII前言本标准按照GB/T112009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位广西壮族自治区兽医研究所。本标准主要起草人李军、潘艳、彭昊、陶立、李常挺、冯世文、马春霞、钟舒红、贺会利、胡帅、谢永平、杨威、陈泽祥DB45/TXXXXXXXXX1山羊支原体肺炎防控技术规程1范围本标准规定了山羊支原体肺炎防控技术规程的环境质量及卫生控制、管理措施、诊断、防治措施和无害化处理。本标准适用于广西山羊养殖场山羊支原体肺炎的防控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB16549畜禽产地检疫规范GB16567种畜禽调运检疫技术规范NY/T541动物疫病实验室检验采样方法NY/T1167畜禽场环境质量及卫生控制规范NY5027无公害食品畜禽饮用水水质NY5032无公害食品畜禽饲料和饲料添加剂使用准则NY5149无公害食品肉羊饲养兽医防疫准则3术语和定义31山羊支原体肺炎CAPRINEMYCOPLASMALPNEUMONIA是感染并引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎、流产与不孕等多种疾病的一种不具有细胞壁的原核微生物。4环境质量及卫生控制羊场环境质量及卫生控制按照NY/T1167的标准规定执行。5管理措施51制定和严格执行人员管理、饲养管理、卫生消毒（蚊蝇控制）、无害化处理等制度。52建立完整的投入品使用、免疫、疫病诊疗、用药、消毒、产品销售和无害化处理等记录，并整理归档，做到可以溯源。53场外人员及车辆不得随意进入生产区，工作人员必须更衣换鞋并经严格消毒方可进入生产区。DB45/TXXXXXXXXX254场区内不能饲养其它动物，不能开展对外诊疗和配种工作，不能带入可能染疫的畜产品。55羊场应配备兽医人员，并严格执行卫生消毒、免疫、检疫、监测等制度。56坚持自繁自养的原则，育肥羊实行全进全出的饲养管理制度，山羊出栏后，羊舍要严格进行清扫、冲洗和消毒，并空圈7D以上后方可再进羊饲养。57必须从外场引进山羊时，要确认产地为非疫区。引进后隔离舍饲养45D，进行观察、检疫、监测，确认为健康后方可混群。58投入品的使用应符合国家有关规定。6诊断61流行病学611病原引起广西地区山羊支原体肺炎的病原体主要有绵羊肺炎支原体（MOVIPNEUMONIAE）、丝状支原体山羊亚种（MMYCOIDESSUPSPCAPRI）。该类支原体均为细小、多形性的微生物。革兰氏染色阴性，瑞氏、美兰和姬姆萨染色着色良好。对理化因素的抵抗力弱。612易感动物易感动物为山羊，其中以3岁以下的山羊最易感染。613流行特点本病呈地方性流行，一年四季均可发生和流行，以阴雨连绵、寒冷潮湿、天气冷热交替的季节多发。614传播途径本病接触传染性强，发病后迅速在羊群中传播。病羊肺组织和胸腔渗出液含有的大量病原体主要以空气飞沫的方式经呼吸道传播。615发病因素异地运输、饲养方式、环境条件改变等应激因素是山羊支原体肺炎的诱发因素，同时山羊支原体感染对机体免疫系统造成极大的破坏作用，也进一步促进继发感染或混合感染的病原微生物的致病作用。除细菌和病毒的混合感染外，寄生虫感染可能对山羊支原体肺炎的发生也有促进作用。62临床症状621慢性型全身临诊症状轻微，体温升至40左右。病羊间或有咳嗽，鼻液时有时无，被毛粗乱无光泽。如果饲养管理不良，与急性病例接触或机体抵抗力降低时，很容易出现并发症而死亡。622急性型病初体温升高，出现短而湿的咳嗽，伴有浆液性鼻液,精神沉郁,采食量逐渐减少。4D5D后，咳嗽变干而痛苦，鼻液转为黏液脓性并呈铁锈色，黏附于鼻孔和上唇，结成干涸的棕色痂垢。眼睑肿胀，DB45/TXXXXXXXXX3流泪，眼有黏液脓性分泌物。口半开张，流泡沫状唾液。头颈伸直，腰背拱起，腹肋紧缩，呼吸困难。濒死前体温降至常温以下。病程多为7D15D，有的可达30D。不发生死亡的转为慢性。623最急性型发病急，体温高达4142，精神萎靡不振，食欲废绝，呼吸急促而有痛苦鸣叫。数小时后出现肺炎症状，呼吸困难，咳嗽，流浆液带血鼻液，肺部叩诊呈浊音，听诊肺泡呼吸音减弱、消失或呈捻发音。病羊卧地不起，四肢伸直，呼吸极度困难，随着呼吸全身颤动。黏膜高度充血，发绀。病程一般不超过45D，有的仅12H24H，有的在没有任何征兆情况下突然倒地死亡。63病理变化肺呈紫红色，切面呈大理石样，充血水肿，有出血点。胸腔常有淡黄色液体。胸膜变厚而粗糙，胸膜和肺表面有黄白色豆腐渣酪样物。心包积液、黏连，心肌松弛、变软。64实验室诊断641病原分离6411按照NY/T5412002操作规程无菌取病羊肺组织一小块。6412按15体积比加入生理盐水匀浆，4000R/MIN离心5MIN，取上清液经022M滤器过滤后，接种到含体积分数为20马血清PPLO肉汤培养基（内含1000IU青霉素）中，置37体积分数为5CO2培养箱中培养57天。6413对培养24H后才开始变黄且液体清亮的培养物，经022M滤器过滤后，按体积分数为10（V/V）的接种量将滤液接种到含体积分数为20马血清PPLO肉汤培养基（不含青霉素）中继续培。6414若培养基的颜色仍然变为黄色，则将其在PPLO固体培养基上划线分离，置37体积分数为5CO2培养箱中培养。6414培养72H可见有白色菌落生长，菌落直径大小在032MM，40光学显微镜下观察绵羊肺炎支原体菌落为菌落为无中心脐、园形、中间隆起、边缘整齐透明，类似“帽子”状的菌落形态，而丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊亚种为有明显中心脐的“煎蛋样”菌落。6415培养72H可见有白色菌落生长，菌落直径大小在032MM，40光学显微镜下观察绵羊肺炎支原体菌落为菌落为无中心脐、园形、中间隆起、边缘整齐透明，类似“帽子”状的菌落形态，而丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊亚种为有明显中心脐的“煎蛋样”菌落。6416菌体革兰氏染色，可见红或紫色的染色颗粒，具体形态不易分辨；姬姆萨染色可见菌体呈浅灰蓝色的多形态结构，有球状、棒状、环状等，大小不一，有的在菌膜上可见23个深染的极点。642基因检测检测方法按照附录A规定的方法执行。643血清学诊断检测方法按照附录B规定的方法执行。7防治措施71预防措施711加强检疫监管DB45/TXXXXXXXXX4建立基础母羊群，自繁自养。品种调整或补充种源，加强山羊群引进的管理，应按照GB16549和GB16567的规定，进行检疫。养殖场所用的饲料要求按照NY5032的规定执行；饮水要求按照NY5027的规定执行；饲养管理按照NY5149的规定执行；环境控制应符合NY/T1167的规定。712封锁和隔离养殖场实行封闭管理，控制疫病的传播，对入场人员和车辆进行消毒。对发生疫情的养殖场实行封锁，对病羊进行隔离治疗，对无治疗价值的重症病羊按照GB16548的规定，进行无害化处理。同时禁止山羊的外运和引进，避免疫情的扩散。713免疫接种对健康羊群每年春季或秋季预防接种一次。山羊传染性胸膜肺炎氢氧化铝灭活疫苗。皮下或肌肉注射，6月龄以上山羊，每只注射5ML，6月龄以下山羊每只注射3ML，免疫期为12个月。对身体瘦弱、体温升高或有慢性疾病的羊，不宜注射。对怀孕母羊、新生羔羊和从异地引进的羊应及时补注射。714加强消毒灭源山羊支原体对环境因素的抵抗力不强，常用消毒剂就能杀灭。对于发生疫情的养殖场和周围环境，每天消毒1次；加强对病死山羊、污染物和排泄物的无害化处理，同时做好灭蝇、灭蚊、灭鼠的工作。715加强饲养管理羊舍要保持干燥和透风，冬天要做好防风和保暖；羊群密度适当，避免过度拥挤；不同年龄、不同来源的山羊分开饲养；饲料品质良好，适当补充精料、维生素和微量元素，保证日粮的全价营养，提高机体抗病力。72治疗加强对病羊护理，隔离饲养。可选用下列抗菌消炎药物为主对山羊支原体肺炎进行治疗泰乐菌素510MG/KG体重、氟苯尼考20MG/KG体重或恩诺沙星25MG/KG体重，肌肉注射，每天1次，连用5D7D。在治疗中，还应根据病羊全身状况，采取相应的对症治疗，如强心、利尿、补液等措施。8无害化处理81养殖场可根据本场的实际情况配套建设无害化处理设施，无害化处理可采用焚烧炉、填埋池（井）或化尸池等方式，处理能力应当能够满足场区范围内及时处置病死羊及死因不明动物的需要。82养殖场在废弃物无害化处理区配套建设粪便和污水处理设施（沼气池、污水分级沉淀池等），处理能力能够满足自身需要。83病死、患传染病死亡的羊只等无害化处理的具体操作方式按GB16548的规定执行。84污染饲料、垫料、粪便等无害化处理可采取堆积发酵或沼气方式进行。85污水的无害化处理可采取分级沉淀池方式或使用沼气等方式进行。DB45/TXXXXXXXXX5AA附录A（规范性附录）特异性引物序列及检测结果凝胶电泳图示A1特异性引物序列A11绵羊肺炎支原体特异性引物A111绵羊肺炎支原体引物核苷酸序列M1BF5CGGAGCCATAAAGTTGTAAT3M1BR5CGAAACTCCCGTGGATGCTA3A112引物扩增的靶基因和长度靶基因膜蛋白扩增长度511BPA12丝状支原体山羊亚种特异性引物A121丝状支原体山羊亚种引物核苷酸序列MMMLC2LCAATCCAGATCATAAAAAACCTMMMLC2RCTCCTCATATTCCCCTAGAAA122引物扩增的目的基因靶基因LPPA扩增长度1049BPA2PCR检测结果凝胶电泳图示PCR检测结果凝胶电泳图如图A1和图A2所示。DB45/TXXXXXXXXX6M、标准DNA分子量（DM2000）；1丝状支原体山羊亚种（）；2隐秘杆菌（）；3曼氏杆菌（）；4巴氏杆菌（）；5绵羊肺炎支原体（）；6水（）注“”表示检测结果为阳性；“”表示检测结果为阴性。图A1绵羊肺炎支原体PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图M、标准DNA分子量（DM2000）；1丝状支原体山羊亚种（）；2隐秘杆菌（）；3曼氏杆菌（）；4巴氏杆菌（）；5绵羊肺炎支原体（）；6水（）注“”表示检测结果为阳性；“”表示检测结果为阴性。图A2丝状支原体山羊亚种PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图DB45/TXXXXXXXXX7BB附录B（规范性附录）微量间接血凝试验B1方法提要微量间接血凝试验可用于羊支原体肺炎的诊断和监测。其原理是利用结合在红细胞上的羊支原体肺炎抗原在与血清中的抗体反应后,出现肉眼可见的凝集现象,据此便可判断被检者血清是否含有羊支原体肺炎抗体。B2试剂羊支原体肺炎间接血凝试验抗原NA2HPO4KH2PO4NACL分析纯B3设备和仪器恒温培养箱离心机微型振荡器天平移液器96孔V型90度孔底微量血凝反应板100ML磨口锥形瓶1000ML容量瓶B4操作步骤B41材料准备B411稀释液取NACL425G、NA2HPO41934G、KH2PO4286G放入1000ML容量瓶中，加蒸馏水完全溶解后定容，过滤分装，15磅15MIN高压灭菌,即成015MOL/L磷酸盐缓冲液PBS。取上述溶液98ML和健康兔血清2ML放入100ML磨口锥形瓶中，混合，无菌分装，4保存备用。B412被检血清无菌采集待检羊血液并分离血清，检验前56灭能30MIN。B42试验DB45/TXXXXXXXXX8B421加稀释液取一洁净96孔V型血凝板,每个样品为一组,1孔5孔加入稀释液30L。B422稀释血清于第1孔加入待检血清30L，用移液器逐孔稀释至第5孔，弃30L，此时15孔待检血清的稀释度依次为121,142,183,1164,1325。同法稀释阳性及阴性血清,阴性血清组稀释至第四孔,预留第五孔作为稀释液对照。B423加间接血凝抗原被检血清各孔、阴性血清各孔、阳性血清各孔、稀释液对照各孔均加间接血凝抗原30L。加完后,振荡混匀,37静置2H,判定结果。B5结果判定B51判定标准A红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底者为,即100凝集；B红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐且稍向孔底集中者为，即75凝集；C红细胞于孔底形成一个环状,四周有小凝集块者为，即50凝集；D红细胞于孔底形成圆团状,但边缘不够光滑,且四周稍有凝集块者为,即25凝集；E红细胞于孔底形成圆团状，且边缘光滑整齐者为，即无凝集。B52判定方法在阳性对照、阴性对照血清，稀释液对照为的前提下，对被检血清进行判定。被检血清18稀释度，凝集值以上判定为阳性，14稀释度凝集价判为可凝，14以下者为阴性。D