《贵州省食品安全地方标准植物性农产品中赤霉素残留量的测定 液相色谱－质谱质谱联用法》编制说明

0CH2HC3HOHCOOHOOOH贵州省食品安全地方标准植物性农产品中赤霉素残留量的测定液相色谱质谱/质谱联用法编制说明（征求意见稿）一、工作简况11目的意义植物生长调节剂（PLANTGROWTHREGULATOR）调节作物正常生理作用和代谢过程的一类农药。近年来，在我国农产品生产加工中的应用日益广泛，已经成为增加蔬菜水果产量、改善品质、提高经济效益的重要手段之一。然而随着研究的深入，有关植物生长调节剂安全性的报道也增多。例如植物天然激素赤霉素，试验发现赤霉素可能影响动物的生长发育，甚至导致机体发生癌变。植物生长调节剂在水果、蔬菜以及茶叶中的残留问题也逐渐受到关注，因此，欧盟、日本、韩国、澳大利亚等多个国家都制定了不同农产品（蔬菜水果）中的残留限量标准。赤霉素是目前我国比较常用的植物生长调节剂，赤霉素也是天然植物激素，对水果、蔬菜和茶叶生长有促进作用。此外，赤霉素还可以改善水果品质，延长贮藏期。赤霉素的理化性质详见表1。目前我国还未指定赤霉素的限量标准，目前澳大利亚、美国、韩国及日本等水果蔬菜进出口大国制定了农产品中赤霉素的限量标准涉及多达110多种农产品。而在我国，目前在水果中赤霉酸残留量的测定已有食品安全国家标准（GB23200212016）外，北京市在豆芽产品中制定了检测方法标准（DB11/T3792006）外，目前还没有其他的方法标准。表1赤霉素的物理化学性质名称化学文摘号CASNO分子量水溶性（MG/L）LOGKOWPKA结构式赤霉素7706534638510302440据不完全统计，目前关于赤霉素检测方法文献方法多达70多种，主要包括液相色谱法（HPLC）、液相色谱法质谱法（HPLCMS）等，应用最广泛的是HPLC。赤霉素的方法标准主要采用高效液相色谱方法，如在水果中赤霉酸残留量的测定已有食品安全国家标准（GB23200212016），豆芽中赤霉酸残留量的测定已有北京市地方标准（DB11/T3792006）。日本厚生劳动省制定的“LC/MS农用化学品同时检测方法”采用液相色谱质谱法能够同时检测赤霉素、噻苯隆及氯吡脲等三种植物生长调节剂。12任务来源承担单位中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所主要起草人金芬、王静、邵华、金茂俊、佘永新、郑鹭飞、王珊珊、史晓梅、张鹏13主要工作过程1项目主持单位组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面（1）了解目前国际上不同种类蔬菜、水果、茶叶中赤霉素的限量值。（2）收集国内外有关蔬菜、水果、茶叶中赤霉素测定方法和标准等资料。比较研究了国内外的不同测定方法的有缺点，并在此基础上进行改善，为方法最终的确定提供了大量的数据支撑。（3）调查了国内许多单位蔬菜、水果、茶叶中中赤霉素测定方法的仪器设备和使用情况，为方法的普适性提供依据。（4）为确定方法分析步骤、仪器测试条件及方法技术参数的评价，本单位和相关协作实验室进行了大量的方法研究、验证实验和数据统计、为标准的起草制定了可靠的第一手资料。在广泛的调查研究和必要的试验验证的工作基础上，根据GB/T112009标准化工作导则第一部份标准的结构和编写规则及GB/T2000142001标准编写第四部份化学分析方法所规定的内容和格式编写完成标准草案，现已形成征求意见稿。二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据21编制原则本标准的编写制定过程以提高测试方法选择性、精密度、灵敏度、准确度和分析效率，降低分析成本为总原则，力求反映科学技术的先进成果和先进经验。遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。与同体系标准及相关的各种基础标准以及配套使用的取样、试剂规格等标准相衔接，遵循了政策和协调统一性原则。在标准制定过程中力求做到技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。22确定主要技术内容的依据目前，赤霉素的测定，日本厚生劳动省已经有标准方法。此方法为“LC/MS农用化学品同时检测方法”。该方法在样品的提取净化部分采用乙腈提取，盐酸氯化钠水溶液液液萃取，硅胶固相萃取小柱净化，前处理方法相对比较繁琐。而基质分散固相萃取法相对于固相萃取法来说更加快速、环保。目前已经有很多基于基质分散固相萃取前处理的检测方法面世。最著名的为美国QUECHERS方法，该方法在农药多残留的测定上显示了快速、简单、绿色环保等优点；但该方法在植物生长调节剂的应用上还研究较少。因此，在现有日本厚生省方法及美国的QUECHERS方法基础上，我们对样品的提取净化过程进行改进和优化，研究确定了使用相对简单快速的前处理的液相色谱质谱法进行检测，该方法可有效的测定农产品中赤霉素（水果和蔬菜）。茶叶和茶青样品含有茶多酚等，具有更多水溶性的杂志，更深的色素，除去色素对于方法的准确性和精密度均有提高，因此，在现有文献方法的基础上，我们对茶叶和茶青的提取净化过程进行改进和优化，2研究确定了使用相对简单快速的前处理的液相色谱质谱法进行检测，该方法可有效的测定茶青和茶叶中赤霉素。三、方法的确定31称样量的确定本方法参考日本厚生劳动省方法确定称样量为520G和QUECHERS方法的称样量。在日本厚生劳动省“LC/MS农用化学品同时检测方法”方法中称样量为520G，提取溶剂乙腈的体积为50ML；而QUECHERS方法的称样量为10G，提取溶剂的体积为10ML。我们对不同称样量的提取效果进行了比较，确定了蔬菜水果样品等称样量为10G。此外，在我国的常规实验室所配置的离心机与离心管通常为50ML，根据QUECHERS方法样品量与提取溶剂11的比例，10G的称样量更易于操作，所以本实验确定样品的称样量为10G。而对柑橘类样品的分析要求是果皮和果肉分别测定残留量，考虑到柑橘类样品果皮部分密度较小，不易离心，且果皮部分的残留量较果肉部分高，所以柑橘类果皮的称样量确定为5G。由于茶青和茶叶颜色较深，茶叶提取物中水溶性杂质较多，色素、生物碱、脂多糖等大分子杂质水溶性杂质较多，考虑到基质干扰，因此茶叶的称样量为2G，茶青的称样量为5G。32提取液的确定依据现有标准和文献方法，试验比较了乙腈溶液以及乙腈乙酸混合液两种提取液对赤霉素的提取效果，详见表2。因为赤霉素结构中含有羧基，它们受PH的影响较大。当在乙腈溶液中加入01的乙酸，果蔬样品中赤霉素的提取效果和色谱峰型都有所改善；因此，在该试验中针对果蔬等农产品使用乙腈01醋酸水的混合溶液进行提取和离心。而对于茶叶和茶青样品，当在乙腈溶液中加入05的乙酸，赤霉素的提取效果更好，因此，在该试验中针对茶叶等农产品使用乙腈01醋酸水的混合溶液进行提取和离心。表2不同提取溶液的提取效果提取溶液组成（V/V）赤霉素回收率（）乙腈756乙腈01醋酸943乙腈05醋酸95233基质分散固相萃取填料的选择依据现有标准和文献方法，试验比较了一种离子交换吸附剂PSA和两种惰性吸附剂ODS、石墨化碳共三种分散固相萃取的填料对样品的净化回收效果。在农残分析中，PSA主要是通过离子交换作用除去样品中的金属离子、部分脂肪酸和糖，在本试验中，PSA为50MG时，对目标物赤霉素有很大程度的保留，影响了目标物的回收效果，如表3所示，赤霉素的回收率仅为523。显然，随着PSA量的增大，赤霉素的回收率不断降低，所以综合考虑回收率及净化效果，未使用PSA作为净化填料。此外，我们比较了不同浓度的GCB的净化回收效果。在以往的农残分析中，GCB主要用于去除叶绿素和类胡萝卜素，对具有平面结构的农药具有一定的吸附。C18作为一种3广谱型的净化填料，虽然它除杂能力没有PSA好，但是综合考虑回收率和净化效果，本实验中选择C18作为果蔬样品净化填料。表3不同分散固相萃取填料的净化回收效果填料剂量（MG）赤霉素回收率（）20114100108C182009850523100437150437PSA2004055201073100886GCB2007834固相萃取柱的选择依据现有标准和文献方法，以及基质分散固相萃取方法中填料的净化回收效果，初步选定了两种惰性吸附剂ODS、石墨化碳固相萃取柱对样品的净化回收效果进行评价。此外，我们比较了不同浓度的ENVICARB的净化回收效果。在以往的农残分析中，GCB主要用于去除叶绿素和类胡萝卜素，对茶叶中的色素去除效果好。综合考虑回收率和净化效果，本实验中选择ENVICARB作为果蔬样品净化填料。表4不同分散固相萃取填料的净化回收效果SPE柱剂量（MG）赤霉素回收率（）203410044C182005220840100886ENVICARB2009034离心过滤将高速匀浆后的样品于10000R/MIN下离心5MIN。吸取12ML上述离心液清液，过02M滤膜净化。依据现有的国际标准及文献方法，多采用聚丙烯（GHP）滤膜。而GHP滤膜的价格4比较昂贵，所以在本研究中比较了两种不同材质的滤膜。一种是WATERS公司的聚丙烯（GHP）滤膜，另一种是国产的有机相滤膜。通过比较发现，两种滤膜对样品的回收率及净化效果没有显著性差异。但国产的有机相滤膜的价格约为1元/个，比进口的GHP滤膜的价格（16元/个）便宜的多。所以，从成本角度考虑，本方法选用经济的国产有机相滤膜。35质谱条件的优化本实验依据赤霉素分子的结构特征，分别选择在正离子和负离子模式下进行全扫描（Q1扫描），确定母离子；在碎片离子扫描模式下，通关改变CE电压条件，确定每种物质的特征碎片离子峰，最后优化MRM定量分析质谱参数如DP、FP、EP、CE和CXP等，以获得更高的灵敏度。本实验使用的质谱仪器为AB公司的API5000，最后确定的质谱条件如下A电喷雾电压IS正离子模式4500V；负离子模式4500V；B雾化气压力GS140PSI；C气帘气压力CUR5PSI；D辅助气流速GS240PSI；E离子源温度TEM450C；F监测离子对、碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口电压（CXP）如表5所示。表5赤霉素碎片离子信息化合物母离子Q1子离子Q3CEVDPVEPVCXPV143140901015赤霉素3452221230901015注为定量离子36色谱条件的选择361流动相梯度表6梯度洗脱程序表5A柱温40；B流速02ML/MIN；C进样体积5L。362流动相酸度的优化选择本研究比较了5个不同乙酸浓度的流动相进行等度洗脱的效果，当流动相中不含乙酸的时候，赤霉素出现前延峰。随着流动相中乙酸浓度的增大，流动相的PH也随之减小，赤霉素色谱峰的前延现象有所改善。当流动相中乙酸含量为01时，赤霉素的峰型对称性得到了很大改善。综合考虑，本实验选择乙酸为05。363缓冲盐浓度的优化选择本研究比较了4种不同浓度的乙酸铵对目标物质分离测定效果的影响。随着流动相中乙酸铵浓度的增大，保留时间发生了明显的变化。鉴于灵敏度和分离度的影响，综合考虑，本实验选择乙酸铵浓度为为5MM。37准确度为考察方法的准确度，我们在不同的蔬菜水果等基质中添加不同浓度的目标物进行回收率的试验。欧盟规定赤霉素的残留限量为5MG/KG。在本实验中选择苹果、葡萄、黄瓜等7种蔬菜水果及茶叶和茶青进行添加回收率试验，具体结果见表5。时间（MIN）5MMOL/L乙酸铵05乙酸水溶液（流动相A）5MMOL/L乙酸铵05乙酸甲醇溶液（流动相B）08515160403560406505010455515595205952385152885156图1不同乙酸浓度下的液相色谱质谱（LCMS/MS）色谱图0表6不同样品基质中目标物添加回收率结果（）赤霉素（GA3）样品添加水平（MG/KG）重复1重复2重复3平均相对标准偏差018829981009670302111110881147112266桔子04853935905898462029861036996101263048210099937108桔子皮089289249069191270189185384286229802110111351138112183苹果04845874898872304018518999368954760280987587985446葡萄04967989995984149011097111511291111440298810231005101174西瓜04803857882847476017638559058418560294810151042100483番茄049010131029786880193288290190527802909931956932252黄瓜0498710521098105533019039539359327202883851896877264油菜048318738978673850195291193293220502823763823803346茶叶049148648828872530190993991392016302823723826791586茶青04801881925869629138精密度381重复性在本实验中，在同一实验室，由同一操作者使用相同仪器设备，按相同的前处理方法和测试方法，在短时间内对农产品样品中的赤霉素进行了6次测定，重复性结果见表610，相对标准偏差在004455范围内，符合重复性试验对相对标准偏差的要求。表7重复性结果赤霉素6次重复测定结果G/KG样品123456平均G/KG标准偏差相对标准偏差RSD番茄15928158681592515549158531570115804149095黄瓜1856418948188061887618691877618776136073油菜19523196421885719080190861924119238295154苹果14709139051427514356143451462314368284198葡萄13066132081334813433135851318613304188141西瓜14798145261442214604148981454614632179122桔子161741620816056160741608616309161510978061桔子皮165231661216475164871654216604165410576035茶青20001202022030520125203212014520237158007茶叶20276201132015720189203242021920213078004382再现性在本实验中，我们选择了不同部委下属的5家实验室，即农业部蔬菜品质监督检验测试中心、中国检科学院综合检测中心、农业部蜂产品质量监督检验测试中心、中国科学院生态环境研究中心环境水质学室及北京市疾病预防控制中心，分别记为实验室1、实验室2、实验室3、实验室4及实验室5，由不同操作人员使用不同的仪器，对本方法进行了验证。通过对苹果、桔子和黄瓜3种蔬菜水果中添加3种不同浓度水平，每个样品平行测定3次，分别计算不同样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项参数，结果详见表1217。3821数据汇总本精密度试验由5个实验室对3个水平作3次测试，测试原始数据及统计结果见下表。2表8植物性农产品中赤霉素残留实验室间原始数据表单位MG/KG苹果样品实验室I12345水平J123123123123123012120180404550010400181803343008480181703890008010165303715008020190303795010840235603852009850175503266008160187903853008840163103702007960194203801赤霉素010840223404416010940185803335008440181603895008740162903776008430192603743桔子样品实验室I12345水平J123123123123123009720229104560008360155403142009810198204062008820186703832008080180303605009740222304493009730140903011009920189403891008030183603783008860179203601赤霉素009170231204128009380153903339009560187203843008560177903863008740182803703黄瓜样品实验室I12345水平J123123123123123008980210603492007570153203322007920196103647008620176303695008017018937038955010360188003610006650170803414007880193703584008840183103702007863018418038017赤霉素011300192004018006810167803918007250185503650087401629037830086350182560384233苹果样品实验室I12345水平J123123123123123赤霉素011270213104273010400181003315008360183703879008530163803731008140192303780桔子样品实验室I12345水平J123123123123123赤霉素009540227504394009160150103164009760191603932008470182703826008560180803636黄瓜样品实验室I12345水平J123123123123123赤霉素010210196903707007010163903551007680191803627008730174103727008170185403847表9植物性农产品中赤霉素残留实验室间单元平均值（MG/KG）苹果样品实验室I12345水平J123123123123123赤霉素546E05841E04137E03297E05270E05179E05304E06130E05526E06205E05177E06156E05661E06372E06104E05桔子样品实验123454室I水平J123123123123123赤霉素104E05215E05541E04508E05633E05274E04340E06339E05133E04162E05199E05163E05175E05340E06328E05黄瓜样品实验室I12345水平J123123123123123赤霉素136E04145E04762E04242E05887E05103E03141E05309E05139E05121E06106E04239E05167E05127E05221E053822异常值的检验38221检验单元方差根据不同实验次数与实验室个数，科克伦检验临界值如下所示。每个水平的最大方差所在实验室编号与科克伦检验的检验值也列于表15。表10各水平单元方差的科克伦检验最大单元方差单元方差之和科克伦检验的检验值C科克伦检验5/1临界值水平J123123123苹果赤霉素546E05841E04137E03114E04886E04142E030477009487096540684/0788水平J123123123桔子赤霉素508E05633E05541E04983E05142E04996E040516604460054290684/07885水平J123123123黄瓜赤霉素136E04145E04103E03192E04383E04185E030707903795055610684/078838222检验单元平均值依据格拉布斯检验计算公式，计算格拉布斯检验统计量GP，判定其检验项目的接受值，详见表16。由GB63972附录B查得当实验室数为5时，格拉布斯检验临界值为1715（5概率水平）和1764（1概率水平）。在各实验室的单元平均值中，用格拉布斯检验未发现歧离值与异常值。单元平均值的格拉布斯检验表明5个实验室测定结果的一致性较好，数据是可信的。表11各水平单元平均值的格拉布斯检验单元平均值最值MG/KG单个高值单侧检验5临界值平均值MG/KG（最大/最小）单个低值单侧检验1临界值水平J1231231230112702131042731373014620139201715苹果赤霉素0093401868037960081401638033150854012790140201764水平J1231231230097602275043941153014760134801715桔子赤霉素0091001865037900084701501031641092013130139901764水平J1231231230102101969038471525010810139501715黄瓜赤霉素0083601824036920070101639035511114013810126401764638223建立R，R与M之间的回归方程经计算，各水平的R，R与平均值M见表12。表12重复性限和再现性限统计平均值MG/KG重复性限R再现性限R水平J123123123苹果赤霉素009340186803796001340003728004721004081005890010346水平J123123123桔子赤霉素009100186503790001241001492003952001905007867012944水平J123123123黄瓜赤霉素008360182403692001737002452005388003682004247014581739方法的线性范围与检出限不同基质对质谱定量有很大影响。本实验在样品前处理过程中充分考查了基质效应，全部采用空白样品添加6个不同浓度目标物混合标准工作液，其中赤霉素的质量浓度分别为10、20、50、100、200和500G/KG制作工作曲线。按照操作方法制备样品溶液，将不同质量浓度的标准溶液在上述选定的液相质谱条件下分别进行测定，进样量为10UL，根据质量浓度与色谱峰面积响应绘制标准曲线和计算回归方程及其相关系数。结果表明赤霉素的质量浓度在10500G/KG浓度范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其相关系数（R2）均大于09900。表13为在苹果基质中添加标准样品的回归方程和相关系数，图2为在线性范围内的标准曲线。表13赤霉素的标准曲线及线性范围名称线性方程相关系数（R2）线性范围