抗原抗体反应PPT演示课件

抗原抗体反应抗原抗体反应是抗原和相应抗体之间所发生的特异性结合反应，这种结合具有高度特异性，它既可以发生在体内，也可以发生在体外。发生在体内的抗原抗体反应，是机体体液免疫效应的表现方式，具有溶菌、杀菌、中和毒素及调理吞噬的作用。,.,发生在体外的抗原抗体反应，根据抗原的物理性状（可溶性Ag或颗粒性Ag）及参加反应的物质不同,可分为沉淀反应、凝集反应、中和试验及补体参与的反应等由于抗体都来自于血清，因此，我们将体外的抗原抗体反应又称为血清学反应。本章讲的抗原抗体反应就是指发生在体外的抗原抗体反应,.,抗原抗体反应原理,1.Ag、Ab能特异性结合：（内因） Ag、Ab能特异性结合，是由于Ag表位(抗原决定簇)和Ab Fab段（V区）之间的特异性结合，二者在空间结构上是严格互补的。,.,2.Ag、Ab结合的动力：（外因）,静电引力（又称库仑引力）： 它是指抗原和抗体分子上带有相反电荷 -NH3+或-COO之间的相互吸引力。 例如Ab分子上赖氨酸离解层中含有 -NH3+，Ag分子上天门冬氨酸离后含有 -COO，这两者之间就可相互吸引而产生静电引力。 该力的大小与两个电荷间距离的平方成反比。距离越近，静电引力就越强。范得华力（又称电子云力）： 该力是原子与原子、分子与分子间所具有的一种吸引力。当Ag、Ab两分子外层轨道上的电子相互作用时，电子云由于偶极摆动而产生吸引力，从而促使Ag、Ab的结合。 该力大小小于静电引力。,.,氢键： 该力是由于分子中的H原子和电负性较大的O、N、S原子间的相互吸引而形成的。 Ag（ -NH2、 -COOH 、-OH 、-SH） Ab （ -NH2、 -COOH 、-OH 、-SH） 可形成氢键桥梁，促使Ag、Ab的结合。 氢键对于维持生物大分子（AgAb）的形态和结构有重要作用。它的大小大于范得华力。,.,疏水作用力： Ab是蛋白质，Ag少数是多糖，多数也是蛋白质，那么它们就是胶体物质，在水溶液中就带有 -NH3+或-COO极性基团，从而带上正电或负电 ，成为亲水胶体。 当Ag表位和Ab Fab段相互靠近时，亲水层消失，排斥掉两者间的H2O分子，促进Ag、Ab的结合。 疏水作用力在整个Ag、Ab反应中提供的作用最大。,.,抗原,抗体,抗原抗体复合物（免疫复合物）聚集在一起,亲水胶体,疏水胶体,.,在高浓度电解质（如NaCl等）存在的条件下，NaCl可先与Ab分子结合（在Ab未与Ag相遇时） ，排斥H2O分子，从而使Ab蛋白质优先沉降，称为盐析现象 由于抗原抗体反应不含有共价键，因此抗原抗体反应不为化学反应，不产生新的物质。 AgAb AgAb 抗原抗体反应特点1.特异性： Ag、Ab的结合实质上是抗原表位和抗体可变区之间的结合。Ab 可变区可形成一个平穴槽，Ag则楔状嵌入，由于两者在化学结构和空间结构上的互补，使得它们的结合具有特异性。 这种结合如同钥匙与锁的关系，一把钥匙只能开相应的一把锁.,.,.,交叉反应,交叉反应(cross-reaction)-抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应称为交叉反应。,B,A,.,交叉反应并没有违背Ag、Ab特异性结合的原则，其产生的先决条件是存在共同Ag表位。 交叉反应的意义：1. 免疫学诊断：（利用交叉反应）eg 外斐氏反应等:用变形杆菌OX19、OX2、OXk作抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致）2.可造成免疫病理损害：eg 链球菌感染后易导致肾小球肾炎，其原因为链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致。,.,2.最适比例：,Ag、Ab的结合并不是在任何比例下都进行得充分、完全的。要形成我们肉眼可见的反应（如沉淀、凝集现象等），就涉及到最适比例问题。以沉淀反应为例：在一排试管中加入等量的Ab，然后依次向各管加入递增量的可溶性Ag，根据形成的沉淀物及抗原抗体比例可见：（图）,.,.,：Ab过剩区，又称前带，此时，上清液中Ab过剩，大多出现的是可溶性抗原抗体复合物。：Ag过剩区，又称后带，此时，上清液中Ag过剩，大多出现的也是可溶性抗原抗体复合物。：是Ag、Ab合适比例范围，又称等价带。在这一带中，Ag、Ab反应充分，形成的沉淀物快而多；其中有一管Ag、Ab反应速度最快、形成的沉淀物最多，上清液中几乎没有游离的Ag或Ab存在。这时候，抗原抗体之间的比例称为最适比（顶点处）。这种现象的产生，可以用网（晶）格学说来解释：当Ab过剩时，形成的是小分子复合物， 肉眼看不见；当Ag过剩时，形成的也是小分子复合物，肉眼看不见；当Ag、Ab比例恰当时，形成的是大分子复合物（网格状），肉眼可见。,.,利用沉淀反应对不同来源的抗血清比较后，发现抗体根据等价带范围不同可分为两种类型：R型抗体：它以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有在Ag过剩时，才出现可溶性抗原抗体复合物。大多数小动物的免疫血清属于该类型。 H型抗体：它以马免疫血清为代表，抗原抗体合适比例范围较窄，在Ag、Ab过剩时，都可出现可溶性抗原抗体复合物。人和多数大动物的免疫血清属于该类型。3.可逆性：Ag、Ab结合形成抗原抗体复合物，这一过程是一个动态平衡，在一定的条件下，反应是可逆的：AgAb AgAb，其主要原因为Ag、Ab结合是非共价键结合，不为化学反应。,.,.,抗原抗体反应的影响因素,自身因素： 1Ag：与Ag的理化性质、抗原表位的数目及种类有关； 2. Ab：与Ab的来源有关：是R 型抗体或H 型抗体； 与Ab的特异性、亲合性有关； 与Ab的浓度有关。,.,外界环境条件：1电解质：一般实验室所用电解质都是生理盐水（0.9% NaCl）,浓度不能过高。浓度过高，会使Ab蛋白质优先沉淀而出现盐析现象。 2PH：一般为PH 6-8,当PH3时，可出现颗粒性的非特异性凝集，称酸凝集；当PH过高，可造成碱变性。 3温度：抗原抗体反应的常用温度为37C。,.,抗原抗体反应的类型,分5大类：沉淀反应；凝集反应；补体参与的溶血反应、补体结合试验； 中和试验;免疫标记技术。,.,思考题：1.抗原抗体反应的原理2.抗原抗体反应的特点3.影响抗原抗体反应的主要因素4.抗原抗体反应分哪些种类？5.什么是交叉反应，有无特异性，为 什么？在临床上有何意义？,.,沉 淀 反 应(precipitation reaction),.,概念： 可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象. Ag 沉淀原 Ab 沉淀素(precipitin)实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释Ag,.,颗粒性抗原：,光镜下可见，肉眼观呈浑浊悬液，如细菌、RBC等。,可溶性抗原：,光镜无形态，肉眼观呈澄清透明，如血清蛋白溶液、多糖抗原等。,凝集反应,沉淀反应,.,分类：液相沉淀：絮状沉淀试验、环状沉淀试验 免疫比浊测定法凝胶扩散：双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩散 试验等凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫电泳、火箭 免疫电泳等,.,一.液相沉淀反应,.,（一）絮状沉淀试验 (flocculation)抗原抗体结合，在电解质存在的情况下出现絮状/块状沉淀既可在试管内进行，也可在玻片上进行。用于：玻片法常用于定性测定,.,试管法在沉淀试验前，应测试抗原、抗体最佳稀释度，一般用方阵滴定方法。半定量检测。,.,方阵最适比测定抗体 抗 原 稀 释 度稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 对照 1/5 + + + + + + 1/10 + + + + + + + 1/20 + + + + + + + 1/40 + + + + + + 1/80 + + + + ,.,（二）环状沉淀反应方法：在环沉管（0.23cm)中进行。 先加抗体，后加抗原。静置 30分钟后观察在Ag、Ab交界处是否有白色沉淀环，若有，为阳性）。 用途：多用于测抗原（法医学上血迹鉴定等）,.,环状沉淀试验,1.毛细玻管，内径1.52mm2.下层置血清（Ab），上层置Ag（不能颠倒）,抗原、抗体相对应，比例恰当，即形成沉淀环,.,.,（三）免疫浊度法(immunoturbidimetry),.,原理,免疫比浊实验是在一定量的Ab中加入递增量的Ag ，反应一段时间后，形成可溶性免疫复合物，此复合物在PEG作用下，自液相析出，形成微粒，使检测浊度发生改变，用浊度计检测相应浊度，浊度高低与复合物含量成正比。绘制标准曲线，根据浊度推算样品中Ag含量。,.,1. 免疫透射浊度测定法原理： 缓冲液中，先加入已知过量Ab，然后加入待测Ag，AgAb复合物的量随Ag量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列标准品对照，即可算出未知Ag含量。优点：该法操作方便、检测快速。临床上多用于检测IgG、IgA、IgM、C3等。缺点：反应时间长；所需Ag /Ab量大。,.,2. 免疫胶乳浊度测定法原 理： 将已知抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，使胶乳颗粒发生凝集，减少透光度。透光度减少程度与胶乳凝聚成正比，当然也与Ag量成正比。本法不易选择适用的乳胶，同时Ab与胶乳结合也困难。,.,二.凝胶扩散(agar immunodiffusion)在凝胶中进行的沉淀反应,.,凝胶扩散试验 可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结合，可出现肉眼可见的沉淀线。（一）双向琼脂扩散试验 （简称 双扩 double immunodiffusion)方法：制琼脂板(3ml 1.5%NS琼脂） 打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型） 加样（平孔沿加满） 扩散（37C、24 h观察结果）,.,双向琼脂扩散试验,抗原 抗体,抗原抗体结合沉 淀 线,.,优点： 简单、易行，用途广用途：1.已知Ag或Ab测未知Ab或Ag：双孔型2.抗原性质分析：三角孔型3.测Ag有效稀释度：梅花孔型,.,测未知抗原或抗体：双孔型,.,抗原性质分析：三角孔型,.,测Ag有效稀释度：梅花孔型,缺点： 敏感性低 出结果慢 只定性，不能定量,.,（二）单向琼脂扩散试验(简称 单扩 single immunodiffusion),.,方法： 已知抗体+琼脂制板、打孔 在琼脂板小孔中加梯度抗原 抗原向四周扩散形成沉淀环 抗原浓度与沉淀环直径呈线性关系 绘制标准曲线 从标准曲线上查出并计算出待测标本含量,.,1,2,3,4,5,待测标本,单向琼脂扩散试验Ag的沉淀环注：15孔为抗原不同梯度量形成的免疫沉淀环,.,沉淀环直径,cm,Ag含量（浓度）,单向琼脂扩散试验标准曲线图,Ag浓度,沉淀环直径,用途：定量测定，如测 IgG、IgA、IgM、C3等含量,.,三. 凝胶免疫电泳(agar gel immunoelectrophoresis)在电场作用下的凝胶扩散,.,电泳技术： 带电胶体颗粒在电场中向相反电极泳动，利用电泳现象研究某些化学组分的分离技术。免疫电泳技术的优点：1.加快反应速度2.规定了抗原、抗体扩散方向，提高反应敏感性3.可将某些带电性不同的组分分开，再进行抗原抗体反应,.,影响电泳的因素：1.与溶液的pH有关：常用pH89，蛋白质带负电2.与溶液离子强度有关：愈高，泳动慢，一般0.020.2M3.与电场强度有关：愈高，愈快，一般46v/cm（琼脂长），约40v左右4.电渗作用的影响 电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象。电渗方向与电泳方向相反。,.,（一）对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis)原理：定向加速的免疫双扩 （双扩电场，使抗原、抗体相对泳动）方法： 抗原、抗体分别在琼脂板上不同孔内，抗原在负极端，抗体在正极端，电泳。电压：46v/cm(琼脂长度）电泳时间：45分钟1小时,.,-,抗原 抗体,对 流 免 疫 电 泳,PH：8.6,Ag：-，借助电泳由负向正极运动；,Ab：-少，分子又大，重，电泳慢， 因电渗反而由正向负极运动。,优点、用途：耗时短，反应敏感性强。用于HBsAg、AFP等检测,.,（二）火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis)原理： 单扩电场，为定量试验,.,方法： 已知抗体+琼脂混合，制板 在玻板一端打孔、加梯度抗原 电 泳 根据所知样品梯度含量 绘制标准曲线 查出待测样品含量,.,-,+,火 箭 免 疫 电 泳,12,34,5,待测,.,优点与用途： 与单扩相同，已知Ab定量测Ag，但出结果快。,.,（三）免疫电泳（immunoelectrophoresis) 多用于分析复杂抗原组分原理： Ag区带电泳双扩结合方法： 1.Ag电泳分出区带 2.Ag、Ab免疫双扩用途：常用于分析复杂Ag的组分。（如人全血清组分的分析）,.,.,-,+,病人血清中缺少这条沉淀线,双扩时加抗体的小槽,人血清免 疫 电 泳 后 的 结 果（有的病人缺少某一条沉淀线，有的病人会出现多一条不该有的沉淀线，均为异常）,正常人血清,病人血清,.,优点： 1.用样品量小 2.特异性高 3. 分辨力强缺点： 由于复杂抗原中各成分含量差异大， 不能全部显出，敏感性不高。用途： 分析复杂抗原组分 多发性骨髓瘤等疾病的测定思考题：1.双扩、单扩、对流免疫电泳、免疫电泳实验的原理，方法，用途。2.影响电泳的因素有哪些？,.,凝 集 反 应(Agglutination),.,概念： 细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在电解质存在下，两者特异性结合，出现肉眼可见的凝聚块。凝集反应应稀释抗体。Ag 凝集原 agglutinogenAb 凝集素 agglutinin分类： 直接凝集反应 direct agglutination 间接凝集反应 indirect agglutination or passive agglutination,.,一.直接凝集反应（direct agglutination) : 细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原（抗原是细胞表面结构）在适当电解质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象。,.,玻 片 凝 集 试 验于玻片上先加已知抗体，再加入待测物（未知抗原），混匀。如发生凝聚，说明待测物中有与抗体相对应的抗原,直接凝集反应分类：（一）玻片法 用已知抗体检测未知抗原,定性试验 用途：1.ABO血型鉴定 2.菌种鉴定,.,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,试 管 凝 集 试 验方法：19号试管分别加不同稀释度待检血清（容量相同，Ab），10号加NS（对照），各管再加定量（浓度、容量一样）的Ag。结果：以出现明显凝集的血清最高稀释度（即可以判为+者）作为该血清（Ab）的凝集效价。,（二）试管法用已知抗原测未知抗体的效价属半定量试验,举例1.肥达氏反应(Widal test) 2.外斐氏试验 (Weil-Felix test),.,二.间接凝集反应(indirect agglutination or passive agglutination) 将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体(carrier)微球上，使之成为颗粒性抗原或抗体，然后再与相应的抗体或抗原结合，出现载体微球的凝集现象,.,（一）载体要求与种类要求： 1.不干预免疫反应 2.颗粒大小均匀常用载体种类：红细胞（绵羊、家兔、人O 型)活性炭粒、硅酸铝颗粒聚苯乙烯胶乳颗粒（人工合成高分子材料）等致敏微粒或致敏颗粒：吸附有抗原或抗体的载体颗粒间接凝集试验命名 根据载体不同而命名 血凝试验（以RBC为载体）乳胶凝集试验（以胶乳颗粒为载体）,.,（二）间接凝集试验的分类：1.（正向）间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体上，检测未知抗体,.,.,.,2.反向间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体上，检测未知抗原,.,.,.,反向间接血凝试验结果判定,如： 反向间接血凝检测HBsAg 、AFP等,.,3.间接凝集抑制试验原理：待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性Ag） 观察是否有凝集现象不凝集为阳性，凝集为阴性。如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液中绒毛膜促性腺激素（HCG）,.,.,.,4 协同凝集试验 （coagglutination)原理：实质为反向间接凝集反应葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus protein A, SPA)能非特异地与IgG的Fc段结合,当与特异性抗原相遇时，IgG的Fab段与抗原结合，出现金葡菌的凝集现象（属特殊间接凝集试验）,.,协同凝集试验,.,协同凝集试验实际是用已知抗体检测未知抗原，可用于多种抗原的检测,.,沉淀试验与凝集试验的比较 沉淀试验 凝集试验抗原性质 可溶性Ag 颗粒性Ag稀释对象 抗原 抗体结果现象 沉淀现象 凝集现象敏感性 低 高,.,.,思考题：1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区别2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验的原理及实例3.协同凝集试验的原理4.比较沉淀试验和凝集试验的异同,.,免疫标记技术,.,用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。,.,免疫标记技术 =,免疫技术+ 标记技术,酶,荧光素,同位素,.,常 用 标 记 物 荧光素 酶 同位素 胶体金 可发光化学物质,.,试验命名： 根据标记物命名 如：免疫荧光技术 免疫酶技术等,.,.,免疫荧光技术（ Immunological fluorescent technique，IF)原理： 用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。免疫荧光技术分类：免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）一.荧光、荧光素及荧光显微镜,.,（一）荧光 一种光照射某种物质时，该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光(二）荧光素 能产生荧光的物质，可作为染料常用荧光素：1.异硫氰酸荧光黄( Fluorescein isothiocyanate , FITC) 可发出黄绿色荧光2.四乙基罗丹明（rhodamine, RB200) 发出橘红色荧光3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC)发出橙红色荧光,.,（三）荧光显微镜 1.结构：主要组成 A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰 紫光； B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧光通过。 C.显微镜：普通的光学显微镜。,.,光路程序： 发射紫外光or兰紫光 紫外光被检物（荧光染色标本）紫外光荧光抑制滤板荧光（显微镜下可见）,白炽光 源,激发滤板,抑制滤板,.,目镜,阻挡滤镜,载玻片,荧光显微镜光路示意图,光源,隔热滤片,激发滤片,聚光器,物镜,荧光显微镜光路示意图,.,荧光显微镜据光源路径分 透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本） 落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）2.使用注意事项：染色后立即检查（荧光易猝灭）准备好后开启白炽光源，不能随时启灭，一般15分钟后才能关闭每次使用2小时 保持室内通风荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体 标记抗原 用得少 标记抗体 用得多 一般免疫荧光显微技术均标记抗体,.,二.免疫荧光显微技术（一）荧光抗体的制备（二）片子的制作（三）