ApoA-I调节LPS处理泡沫细胞锌指蛋白36去磷酸化的抗炎作用及其机制研究-病理学与病理生理学

1中 文 摘 要目的: 观察载脂蛋白 A-I (apolipoproteinA-I, apoA-I) 对脂多糖 (Lipopolysaccharides, LPS) 诱导 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞锌指蛋白 36 (Tristetraprolin, TTP) 去磷酸化和 炎症因子表达的影响，探讨 TTP 翻译后修饰在 apoA-I 抑制巨噬细胞炎症因子表达中的作用及其机制。方法: 体外培养 THP-1 细胞株，用 100 mol/L 的佛波酯 (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) 刺激细胞24h，使其诱导分化为巨噬细胞，并以 50 g/ml 的氧化型低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein, oxLDL) 孵育细胞使其转化为 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞。以 apoA-I 和/或 LPS 处理细胞，采用 ELISA检测白细胞介素-1 (interleukin-1, IL-1)、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor , TNF-)、IL-6 和 IL-8 的表达；采用 Western-Blot 观察 apoA-I 对 LPS 诱导 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞锌指蛋白36 (tristetraprolin, TTP) 和 磷酸化 TTP (tristetraprolin phosphorylation, phospho-TTP)、钙调蛋白(calmodulin, CaM)、钙调神经磷酸酶 (Calcineurin, CaN) 表达的影响。放线菌素D (actinomycin D, Act D) 终止转录后，实时定量 PCR 检测 IL-1 等多种炎症因子 mRNA 的表达。分别使用 CaM 抑制剂(W7)、CaN 抑制剂(FK506)、TTP 小 RNA干扰(siRNA) 处理细胞，以ELISA、实时定量 PCR 等方法分别检测巨噬细胞炎症因子蛋白质和 mRNA 的表达；发色底物法检测 CaM 和 CaN 的活性。结果：相对于 LPS 单独处理组， apoA-I 预处理 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞2h后 显著降低 LPS 诱导的炎症因子 IL-1、TNF-、IL-6 和 IL-8 表达水平；Act D 终止转录后，apoA-I 促进 IL-1 mRNA 的降解；apoA-I 促进 LPS 刺激THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞 TTP 去磷酸化，对 CaN 和 CaM 表达没有影响，但增强 CaM 和 CaN 活性。TTP siRNA下调 TTP 的表达，并明显抑制 apoA-I促进 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞 IL-1 mRNA 降解的效应。W7 和 FK506分别抑制 CaM 和 CaN 活性，并明显抑制 apoA-I 对 phospho-TTP 2表达的下调作用，也抑制了apoA-I 促进 IL-1 mRNA 降解的效应。结论：在 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞中，apoA-I 通过激活细胞内 CaM/CaN 信号转导途径，促进 TTP 去磷酸化，增强 TTP 功能，从而促进炎症因子 mRNA 的降解。关键词：锌指蛋白 36；载脂蛋白 A-I；泡沫细胞；炎症；动脉粥样硬化3ApoA-I inhitits LPS-induced inflammatory cytokines expression in macrophage-derived foam cells via regulating tristetraprolin dephosphorylationABSTRACTObjective: To observe the effect of apolipoprotein A1 (apoA-I) on the expression of inflammatory cytokines and explore the role of TTP-translational modification in the anti-inflammatory effect of apoA-I in macrophage-derived foam cells.Methods: Human THP-1 monocytes were treated in vitro with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (100mol/L) for 24h, and then the medium was replaced by serum-free medium containing oxLDL (50 g/ml) to become fully differentiated macrophage foam cells before their use in experiments. Cells were cultured and treated with apoA-I and (or) LPS. Protein was extracted and subjected to ELISA analysis for interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor- (TNF-), IL-6 and IL-8. Total protein extracts from cells were subjected to Western-Blot analyses for tristetraprolin (TTP), phospho-TTP, calmodulin (CaM), Calcineurin (CaN). The Act D was added to stop the transcription, RNA were extracted and subjected to RT-PCR analysis for inflammatory cytokines mRNA analysis. Cells were treated with CaM antagonist W7, CaN antagonist FK506 and siRNA of TTP. Protein and RNA were extracted and subjected to ELISA or RT-PCR analysis for inflammatory cytokines. Protein was extracted and subjected to chromogenic substrate analysis for CaM and CaN activity.Results: Human THP-1 macrophage-derived foam cells were pretreated by apoA-I for 2h, LPS-induced up-regulation of IL-1, TNF-, IL-6 and IL-8 were significantly 4suppressed relative to LPS alone group. The results of RT-PCR indicated that apoA-I reduced the mRNA levels of IL-1 after treatment of act D. ApoA-I treatment significantly decreased the levels of tristetraprolin phosphorylation, had no effect on expression, but enhanced the activity of CaM and CaN in LPS-stimulated THP-1 macrophage-derived foam cells. Treatment with siRNA for TTP significantly down-regulated apoA-I-induced IL-1 mRNA decay in LPS-treated THP-1 cells. W7, a CaM inhibitor, and FK506 for CaN inhibitor significantly inhibited activity of CaM and CaN, which further abolished the inhibition effect of apoA-I on phospho-TTP expression in LPS-treated THP-1 cells as well as IL-1 mRNA decay.Conclusions: ApoA-I enhanced the interaction of CaN and TTP through a CaM/CaN signaling pathway-dependent manner in LPS-stimulated human THP-1 macrophage-derived foam cells, and apoA-I increased some inflammatory cytokines mRNA decay via promoting the function and dephosphorylation of TTP, which can bind and target ARE-containing mRNAs for rapid degradation.Postgraduate: Jin-feng Li (Pathology & Pathophysiology)Directed by Professors: Yu-lin Tu & Kai YinKey words: Zinc finger protein 36, Apolipoprotein A1, Foam cells, Inflammation, atherosclerosis5引 言动脉粥样硬化(atherosclerosis, As) 是一种慢性免疫炎症性病变，同时也是心血管系统最常见的疾病，严重威胁人类健康，针对其预防和治疗是当前医学研究领域的重要课题。As 的病理变化存在变质、渗出和增生等炎症的基本特征，其中血管壁炎症反应在 As 从发病到出现临床事件过程中都发挥重要作用。单核细胞进入血管壁是炎症反应激活的特征，已被认为是 As 发生发展的关键因素 1。TTP 是一种具有双锌指结构域的 RNA 结合蛋白，主要在巨噬细胞表达，通过与多种炎症因子 mRNA 的 AU 重复序列结合，降低 mRNA 的稳定性，促进其降解 2。 TTP 主要功能为靶向调节体内多种与 As 相关的炎症因子（其mRNA 的 3UTR 均存在与 TTP 结合的 AREs） ，其中包括： TNF-、IL-1、IL-10、IFN- 等 3-5。然而，TTP 磷酸化失活后就不具备降解炎症因子 mRNA 的效应 6-8。炎症状态下 TTP 的磷酸化失活与 p38MAPK 激活有关：促炎因素 LPS通过 TLR4/MyD88 途径激活 p38MAPK，p38MAPK 激活后进一步激活其下游MAPK 激酶-2(MK2) ，MK2 磷酸化 TTP 的 52 和 178 丝氨酸位点，而磷酸化的TTP 与适配蛋白 14-3-3 结合，并与去腺苷化酶分离，失去了对炎症因子 mRNA降解的能力 9, 10。研究发现，活化 CaM/CaN 信号途径后，CaN 能够迅速去磷酸化 p38MAPK 并使其失活 11。最近， CaN 的同源性蛋白磷酸酯酶-2A(protein phosphatase-2A, PP-2A)也被发现可以直接去磷酸化 TTP 和 p38MAPK12，而且，TTP 的磷酸化位点为 52 和 178 号丝氨酸，而 CaN 主要去除丝 /苏氨酸上的磷酸基团。因此明确调节 TTP 去磷酸化的机制对于 As 的慢性炎症特征及其防治具有重要意义。载脂蛋白 A1 (apolipoproteinA-I, apoA-I)是血浆高密度脂蛋白 (high density lipoprotein, HDL) 的最主要成分，具有抗 As 的作用，因其具有参与体内胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT) 的特性，在代谢性相关疾病中发挥重要作用而引起研究者的广泛关注。近年来还发现 apoA-I 具有抗炎效应，由此在炎症性相关疾病尤其是 As 中广泛研究。研究显示，apoA-I 通过与三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1) 结合具有类6似于配体/受体结合的高饱和性和亲和性，可迅速激活巨噬细胞内多条信号途径，如激活细胞内 CaM/CaN 信号转导通路 13, 14。CaN 又称为蛋白磷酸酯酶-2B(protein phosphatase-2B, PP-2B)，是体内分布广泛的、参与多种细胞功能调节的丝/苏氨酸磷酸酶 15。最近，CaN 的同源性磷酸酶 PP-2A 被发现可以直接去磷酸化 TTP15，本课题组前期研究发现，apoA-I 能够显著增加 LPS 刺激巨噬细胞中 TTP 水平，降低炎症因子表达 16。apoA-I 增加 TTP 水平抑制炎症因子表达的机制是否与细胞内 CaM/CaN 信号转导途径有关尚待研究。综合以上文献，我们推测：apoA-I 可能通过激活 Ca2+ 依赖的 CaM/CaN 信号途径促进 TTP 去磷酸化，增强炎症状态下 TTP 功能，从而抑制多种炎症因子表达。因此，本研究拟观察 apoA-I 对 LPS 刺激下 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞 TTP 去磷酸化及其炎症因子表达的影响，并探讨 apoA-I 调节巨噬细胞 TTP去磷酸化的作用及其分子机制。7实验材料一、主要实验试剂1. 人 THP-1 细胞购自于中科院上海细胞生物所细胞中心；2. RPMI 培养基 1640 购自于美国 Gibco 公司；3. 重组人 apoA-I 购自于以色列 Prospec 公司；4. 胎牛血清购自于杭州四季青公司；5. 佛波酯(PMA) 购自于美国 Sigma 公司；6. 油红 O 染色试剂购自于美国 Sigma 公司；7. 重组人 apoA-I 购自于以色列 Prospec 公司；8. RIPA 裂解液（强）购自于碧云天生物技术有限公司9. DEPC 水 购自于美国 Amersco 公司；10. PVDF 膜购自于 Minipore 公司；11. 环孢霉素A(cyclosporine A , CsA) 购自于 Sigma-Aldrich 公司；12. FK506 购自于 A.G. Scientific 公司；13. 预染蛋白分子量标准 PageRullerTM Plus Prestained Protein Ladder 购自于Fermentas 公司14. Effectene Transfection Reagent 转染试剂盒购自于 Qiagen 公司；15. 丽春红染色试剂购自于 Sigma 公司；16. 酶联免疫吸附法 (ELISA) 试剂盒购自于 R&D Systems 公司；17. -Actin 兔抗人（一抗）购自于武汉博士德公司；18. phospho-TTP 兔抗人（一抗）购自于 abcam 公司；19. TTP 兔抗人（一抗）购自于 abcam 公司；20. CaN 兔抗人（一抗）购自于 abcam 公司；21. CaM 兔抗人（一抗）购自于 abcam 公司；22. 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（二抗）购自于武汉博士德生物工程有限公司；23. 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成；24. 250bp DNA Ladder 购 自于 Fermentas 公司；825. 5loading buffer 购自于 Fermentas 公司；26. TRIzol 试剂盒购自于美国 Gibco 公司；27. 逆转录试剂盒(ReverAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit, #k1622) 购自于 Fermentas 公司；28. 实时荧光定量 PCR 试剂盒(DyNAmo TM SYBR Green qPCR Kits) 购自于Fermentas 公司；29. BCA 蛋白含量测定试剂购自于美国 Rockfold 公司；30. Biomol greenTM 磷酸酶检测试剂盒购自于美国 Bioresearch 公司；31. ECL plus 荧光检测试剂盒购自于碧云天生物技术有限公司；32. X-光底片购自于美国 Kodar 公司。33. 其它试剂均为国产分析纯。二、主要仪器与器材1. HIPAS-1000 型图像分析系统（武汉华海公司生产）；2. 垂直电泳仪及转膜系统（美国 BioRad 公司生产）；3. GOS7500 型凝胶成像分析系统（美国 UVP 公司生产）；4. 5804 型及 5804R 型高速离心机（5804 型、5804R 型，德国 Eppendorf 公司生产）；5. 超速离心机（日本日立公司生产）；6. CO2 细胞培养箱（Shelodon 公司生产）；7. 倒置生物显微镜（型号 BX51，日本 Olympus 公司生产）；8. SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术公司生产）；9. 电动移液器（德国 Eppendorf 公司生产）；10. 微量移液器（2.5l 、10l 、100l、1000l，德国 Eppendorf 公司生产）；11. DNA Thermal Cycler（美国 Perkin Elmer 公司生产）；12. 卧式电泳槽（北京六一仪器厂生产）；13. 定量 PCR 仪（德国 Eppendorf 公司生产）；14. 超低温冰箱（日本三洋公司生产）；915.