小麦全蚀病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定

江西农业学报2012，24(11)：5355 Acta Agriculturae Jiangxi 小麦全蚀病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定 吴贤兵 ，孙睿揆 ，昊毅歆 ，王志远 ，吴兴兴 ，毛自朝 ，何月秋 (1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201； 2云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201) 摘要：利用菌饼对峙法从云南省的土样中分离出了234株对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis vartritici)有拮抗 作用的细菌，其中Kc菌株使用浓度为33 x10 cfumL的发酵液浸泡小麦种子1 min后，盆栽试验的防效达到5665，略高 于50多菌灵_WP(1：100)拌种对照处理的效果。从形态和生理生化特征上可将Kc茵株鉴定为芽孢杆菌属，16S rDNA序列 与菌株Bacillus amyloliquefaciens DSM7同源性达995，被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。 关键词：小麦全蚀病；拮抗细菌；16S rDNA；芽孢杆菌；生物防治 中图分类号：$435121文献标识码：A文章编号：10018581(2012)l1005303 Screening and Identification of Biocontrol Bacillus Strains against Takeall of Wheat WU Xianbing ，SUN Ruiku ，WU Yixin ，WANG Zhiyuan ，WU Xingxing2，MAO Zichao ，HE Yueqiu (1Facuhy of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pest Control，Ministry of Education，Yunnan Agricultural University，Kunming 65020l，China) Abstract：With a disc confrontation assay，234 bacterial isolates antagonistic to Gaeumannomyces graminis vaFtritic 。the patho gen of wheat takeall diseasehave been isolated from the soils in Yunnan provinceAmong them a strain Kc controlled 5665of the disease in the pot experiment when its suspension of 3310 cfumL soaked wheat seeds，showing better than 5 L Carbenda zimThis strain Was identified as Bacillus amyloliquefaciens on the basis of its morphologica1physiological and biochemical charac tersand its 16S rDNA sequence had 995homology with that of Bacillus amyloliquefaciens DSM7 Key words：T eall of wheat：Antagonistic bacterium：16S rDNA：Bacillus；Biocontrol 小麦全蚀病又称立枯病、黑脚病，是一种典型的根部 土传病害。全蚀病是小麦生产上的毁灭性病害，由子囊 菌亚门的禾顶囊壳菌小麦变种(Gaeumannomyces gramims vartritici G g t)侵染所致，容易引起植株成簇或大片 枯死、白穗，降低有效穗数、穗粒数及千粒重，发病轻者可 造成小麦减产1020，重者可达50以上，甚至绝 收 J。自1852年在澳大利亚最先发现小麦全蚀病，1868 年首次报道 。现在已成为世界各地普遍发生的重要 病害。我国自1931年前后在浙江发现此病后，目前已经 蔓延至绝大部分省区，呈扩大蔓延或加重发生的趋势，且 国内外均缺乏抗性品种 。目前生产上主要采取以化 学药剂拌种和生长期喷雾进行防治，常用的农药有甲基 硫菌灵可湿性粉剂、全蚀净、消蚀灵、多菌灵、三唑酮等。 化学药剂的大量使用不仅给环境带来污染，加重了植物 病原菌的抗药性 ，而且还会在小麦中引起农药残留，不 利于人类身体健康。 国内外利用微生物之间的拮抗作用来防治植物病 害已有较多的研究 。而对于小麦全蚀病，目前报道得 较多的是荧光假单胞杆菌(Pseudomoru ce， )，但 尚缺乏高效的生物防治制剂 。芽孢杆菌(Bacillus)具 有内生芽孢、繁殖速度快、营养需求简单、抗逆性强、易定 殖等特点，目前已成为生防细菌的研究热点。韩艳霞 等 利用盆栽试验，发现蜡样芽胞杆菌(Bcereus)JK14 对全蚀病的防效达64；王刚等 利用菌饼对峙法，发 现蜡样芽胞杆菌B37菌株对小麦全蚀病的抑制效果 达67。本研究通过对峙培养和盆栽试验，筛选土壤微 生物菌株，以期获得能有效控制小麦全蚀病的芽孢杆菌 菌株，并开展分类鉴定，为该病的田间生物防治打下 基础。 l材料与方法 11材料小麦品种为云麦53，由云南省农科院于亚 雄研究员提供。小麦全蚀病菌株由华中农业大学姜道宏 教授惠赠，枯草芽孢杆菌B168菌株由德国洪堡大学Bor- riss教授惠赠。化学对照药剂为50多菌灵可湿性粉剂 (江苏蓝丰生物化工股份有限公司生产)。用于生防菌 株筛选的土样来自云南省各地。 12试验方法 121拮抗芽孢杆菌的分离取10 g土样加入到90 mL无菌水中，稀释成菌悬液，在70条件下水浴10 min，以杀死不耐高温的真菌、细菌等多种土壤微生物。 收稿日期：20120626 基金项目：科技部国际科技合作项目(2009DFA32360)。 作者简介：吴贤兵(1985一)，男，湖南石门人，硕士研究生，主要从事植物病害生物防治工作。 通讯作者：何月秋。 54 江西农业学报 24卷 然后摇床振荡1 h，使细菌充分悬浮于无菌水中，稀释成 一系列的浓度梯度，分别取10、10 稀释倍数的悬液涂 布在LB培养基上。37培养箱中培养24 h，选取形态 不同的单个菌落，与全蚀病进行对峙培养。 122拮抗芽孢杆菌的筛选利用菌饼对峙 的方法 筛选拮抗菌株。用直径05 am的打孔器将长满全蚀病 菌的PDA培养基打成菌饼，然后将菌饼接种在新的PDA 培养基平板的中央，28。c下培养3 d后，在距离中央25 cm的地方接芽孢杆菌，每皿4个供试细菌，设不接种芽 孢杆菌为空白对照。待空白对照长满整个培养皿后，观 察结果。测量抑菌直径，按如下公式计算抑菌率： 抑菌率= 123盆栽试验盆栽试验设在云南农业大学工程中 心温室。将小麦于锅中煮15 rnin左右，晾干，分装到三 角瓶中，灭菌后接种小麦全蚀病菌饼。28下培养15 d 左右，待菌丝布满整个小麦粒表面后用于接种。按照董 建力等 的菌粒和菌饼接种方法，将带菌小麦粒与土按 5：100混合均匀，置于小盆中，其上放置8个菌饼，每个菌 饼上放1颗表面消过毒、以细菌发酵液(含活菌)浸泡1 min，且已萌芽的麦粒，同时设50多菌灵WP(1：100)拌 种、清水和全蚀病菌3个对照，每个菌株重复3次。调查 方法参照董建力等口。及李洪连等 ，病根率=(病根 数总根数X 100)。病情指数根据通用分级标准体系 计算 。 124形态特征观察及生理生化鉴定生防细菌的形 态特征及生理生化特性鉴定包括：芽孢染色、革兰氏染 色、柠檬酸盐的利用、淀粉水解、硝酸盐还原、吲哚产生、 明胶液化、丙酸盐利用等，参照细菌鉴定的常用方 法 “ ，以革兰氏阳性菌株B168及革兰氏阴性菌株大 肠杆菌DH5tx作为对照。 125 16S rDNA序列的克隆与比对采用CTAB法提 取细菌总DNA，利用细菌通用引物P (5一GAG AGT rlTG ATC CTG GCT CAG一3)和P6(5一CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA一3)对细菌总DNA进行扩增。PCR 反应体系(50 )包括：模板DNA 50 ng，Easy Taq DNA 聚合酶25 U，dNTPs 02 mmolL，10Easy Taq Buffer 5 L，P0(10 txmolL)和P6(10 ixmolL)各02 L，用灭菌 双蒸水补足至50 IxL。PCR反应程序为：94、5 min，94 cI=、1 min，55、1 min，72 oC、2 min，35个循环，最后72 延伸10 min。扩增产物经08的琼脂糖凝胶电泳， 将回收后的16S rDNA片段连接到pMD18一T载体上，并 转化到大肠杆菌DH5ct中，通过蓝白斑筛选挑取阳性克 隆，以菌落PCR再次验证阳性克隆。选验证后的克隆送 至上海生工生物技术有限公司测序，将序列在国际核酸 数据库(http：wwwncbinlmnihgovblast)中比对 分析。 2结果与分析 21拮抗细菌的筛选利用菌饼对峙法，总共筛选到 234株在平板上对小麦全蚀病有拮抗作用的细菌，其中 效果较好的7个菌株见表1。 表1不同生防菌株对小麦全蚀病的抑茵效果 22盆栽试验 利用234株有抑菌效果的菌株发酵液 拌种和盆栽试验，测定了其对小麦全蚀病的防治效果，各 菌株均有一定防治效果，但以菌株Kc处理的效果最好。 未加生防菌处理的对照小麦病根率、病情指数分别达 9610和9444，多菌灵拌种处理的小麦病根率和病情 指数分别为4262和449l，菌株Kc处理的病根率和 病情指数分别为4129和4101，防治效果达5665， 略高于多菌灵处理的防治效果；菌株N一8和251的防 治效果与多菌灵处理相当(表2)。 表2不同细菌对小麦全蚀病的防治效果 注：同列大、小写字母分别表不在1、5水平上的显著性，相同则 不显著，不同则显著。 23拮抗菌株的形态特征及生理生化特性通过生理 生化试验，鉴定了Kc、251、N一8、N一9、KR13等5个拮 抗菌株的16个生理生化特征(表3)。其中Kc的菌体呈 短杆状、革兰氏染色呈阳性、芽孢近端生，在LB平板上 37下培养24 h后，单个菌落呈圆形、乳白色、不透明、 边缘整齐，菌落大小约为1012 mm。葡萄糖利用、柠檬 酸盐利用、VP反应、接触酶反应、硝酸盐还原、淀粉 水解、明胶液化等均呈阳性。选择试验室常用的革兰氏 阳性菌株168及革兰氏阴性菌株大肠杆菌作为对照。 24 Ke的16S rDNA序列及其同源性分析利用细菌 通用引物P。和P ，以防治效果较好的菌株Kc全基因组 为模板，PCR扩增出了1条1507 bp的16S rDNA片段。 11期 吴贤兵等：小麦全蚀病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定 55 将该序列在NCBI上进行BLAST同源性比对，结果表 明：供试菌株Kc的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的标准 菌株同源相似度大部分在99以上，尤其与序列号为 NC0145511的标准菌株Bacillus amyloliquefac 瑚DSM7 同源性最高，达995。将GenBank数据库中同源性最 高的9个菌株与Kc菌株的16S rDNA序列构建系统发育 树(图1)，Kc菌株与标准菌株NC014551。1 Bacillus amyloliquefaciens DSM7在同一分支上。将此结果与菌落 形态、菌体特征以及生理生化鉴定结果综合分析，菌株 Kc鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus n 。幻 e珊)。 表3 5个拮抗菌株的生理生化鉴定结果 注：“+”为反应呈阳性；“一”为反应呈阴性；NT为无。 0003 0002 0002 腑f肌 口myloliq 向cf DSM7 解淀粉芽孢杆菌 ： L 觑 Kc 0010Bac illu spLumiluBsnct c 业 c cf fd Bacillusfirmus 丽i Bacillus megaterium Bacillusfastidiosus Bacillus coagulans 图1菌株Kc的16S rDNA序列的系统发育树 3小结与讨论 云南省曾有过全蚀病的发生 ，但并没有大面积传 播及特别严重发病的报道，其中原因不祥。本试验采用 7O加热法，去除杂菌，靶向分离耐热芽孢杆菌，并从中 筛选能防治小麦全蚀病的有效菌株，不仅可以提高筛选 效率，更有利于田间防治。从云南多个地区土样中分离 到234株对小麦全蚀病有拮抗作用的细菌，通过盆栽试 验发现，Kc对小麦全蚀病防治效果最好，防效达到 5665；N一8及251的防效分别达到5214和 4841，显示了良好的应用前景。试验中采用了高剂量 的病原菌接种，如未加生防菌株和多菌灵拌种的空白对 照病根率高达9610，病情指数高达9444；菌株处理 仅采用短期简单浸泡处理，且直接将小麦粒播种到全蚀 病菌的菌丝块上和土壤中拌有大量病菌，这种高剂量和 有利于发病的条件在田间可能不多见，因此，筛选到的生 防菌株实际防治效果可能高于本研究所得到的效果。但 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 蜡状芽孢杆菌 环状芽孢杆菌 坚强芽孢杆菌 巨大芽孢杆菌 苛求芽孢杆菌 凝结芽孢杆菌 究竟各生防菌株的防治效果如何?还有待田间应用试验 加以验证。 试验中发现，生防细菌的盆栽防效与抑菌圈大小无 关，这是因为生防菌株在土壤中发挥作用受多种因素影 响，如菌株自身的定殖能力、环境因素等 。在盆栽试 验过程中发现，随着生防菌施用次数的增加，防治效果增 加；随着病原菌浓度的增加，防治效果下降，这显然与生 防菌株的定殖能力和数量有关。本研究在较短时间内筛 选到了234株芽孢杆菌，这与前期仅测病根率，而未测定 各株病根长度，加快了筛选进度有关。 参考文献： 1孙虎，薛保国，杨丽荣，等小麦全蚀病拮抗木霉ZBS6的分离、 筛选及鉴定J河南农业科学，2010(6)：7983，86 2彭丽娟小麦全蚀病的发生及综合治理J贵州农业科学， 2008，36(3)：7376 (下转第58页) 58 江西农业学报 24卷 内生长并为害多种植物。这类病菌在高温高湿条件下形 成大量的分生孢子，借雨水、潮湿气流、昆虫传播，从伤 口、自然孔口处侵入。该病害发生与气候、栽培管理条件 密切相关，高温多雨下发病严重，胡椒园缺肥积水时发病 严重。总之，在加强胡椒园管理的同时，要注重对胡椒病 害的监控，时刻警惕新病虫害的发生及主要病害的暴发 流行。 参考文献： 1龙宇宙热带特色香辛饮料作物农产品加工与利用M海 口：海南出版社，2007：63113 2吕玉兰，黄家雄潞江坝胡椒种植面积严重萎缩原因分析及发 展建议J云南热作科技，2007，30(4)：2022 3吕玉兰云南潞江坝胡椒死株情况调查J云南热作科技， 1999，22(3)：14 4林日甫海南胡椒产业可持续发展对策探讨J中国热带农 业，2007(3)：1315 5崔昌华，郑服从，贺春萍，等海南胡椒主要真菌病害调查与病 原鉴定J安徽农业科学，2011，39(6)：33553358 6方中达植病研究方法(第三版)M北京：中国农业出版 (上接第55页) 3罗俊国，邓望喜，谭诂德小麦全蚀病的发生、诊断和防治J 湖北植保，2009(4)：1213 4罗兰，袁忠林，陈茎小麦全蚀病菌拮抗细菌的筛选及鉴定 J莱阳农学院学报，2006，23(3)：205207 f51 Whipps J MMicrobial interactions and biocontol in the rhizo sphereJJournal of Experimental Botany，2003，52(1)：487 5l1 6韩艳霞，陈太政，侯彦喜，等小麦全蚀病拮抗微生物的分离及 其拮抗性能研究J河南农业科学，2007(8)：6o一63 7韩艳霞，胡斌杰，王宫南蜡样芽胞杆菌JK14对小麦全蚀病的 防治及其抑菌机理J农业科学与技术：英文版，2008，9(1)： 7O一74 8王刚，沈永红，王俊芳，等蜡样芽胞杆菌B37菌株对小麦全 蚀病的抑制作用J河南大学学报：自然科学版，2005，35 (1)：6264 9孙广宇，宗兆锋，王建明，等植物病理学实验技术M北京： 中国农业出版社，2001：2329 社1998 7易润华，朱西儒，周而勋简化CTAB法快速微量提取丝状真 菌DNAJ湛江海洋大学学报，2003，23(6)：7273 8彭秀玲，袁汉英，谢毅，等基因工程实验技术(第二版) M1997 9卢圣栋现代分子生物学实验技术M北京：高等教育出版 社。1993 10White T J，Brans T，Lee SAnalysis of phytogenetic relation ships by amplification and direct se