玉米灰斑病研究方法Ⅰ玉米灰斑病菌孢子的培养

1994-2016 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 2011 , 37 (2) :1562158 Plant Protection收 稿 日 期 : 2010202219 修 订 日 期 : 2010203212基 金 项 目 : 云 南 省 支 撑 计 划 项 目 (2006N G19) ;云 南 省 农 业 产 业 技 术 体 系 项 目3 通 信 作 者 E2mail :ynf h2007 163. com玉 米 灰 斑 病 研 究 方 法 : .玉 米 灰 斑 病 菌 孢 子 的 培 养赵 正 龙 1 , 吴 兴 兴 1 , 毛 自 朝 2 , 何 月 秋 1 ,2 3(1. 云 南 农 业 大 学 农 业 生 物 多 样 性 应 用 技 术 国 家 工 程 研 究 中 心 , 昆 明 650201 ;2. 云 南 农 业 大 学 农 学 与 生 物 技 术 学 院 , 昆 明 650201)摘 要 为 了 明 确 玉 米 灰 斑 病 菌 的 产 孢 条 件 ,将 玉 米 灰 斑 病 菌 接 种 到 马 铃 薯 蔗 糖 ( PSA) 、 燕 麦 番 茄 碳 酸 钙 (O TCA) 、玉 米 叶 粉 碳 酸 钙 (ML PCA) 、 燕 麦 粉 (OA) 、 粗 面 粉 (CWPA)等 5 种 培 养 基 上 ,于 25 下 培 养 ,测 定 该 菌 生 长 速 度 、 产孢 时 间 和 产 孢 量 。 结 果 表 明 ,菌 丝 在 上 述 培 养 基 上 生 长 速 度 均 较 慢 ,每 天 平 均 生 长 0. 33 mm 左 右 ,其 中 以 在 OA 和PSA 上 生 长 速 度 相 对 较 快 。 基 于 上 述 结 果 ,构 建 了 玉 米 灰 斑 病 菌 孢 子 培 养 的 二 级 分 段 培 养 法 ,即 将 菌 丝 块 接 种 于加 有 10 15 粒 直 径 为 5 mm 玻 璃 珠 的 马 铃 薯 蔗 糖 ( PS)液 体 培 养 基 三 角 瓶 里 ,在 25 ,180 r/ min 条 件 下 振 荡 培 养15 d ,形 成 菌 丝 悬 液 ,再 取 菌 丝 悬 浮 液 涂 布 在 ML PCA 培 养 基 上 ,避 光 培 养 13 d 左 右 ,可 获 得 大 量 供 接 种 的 分 生 孢子 。 长 期 光 照 促 进 菌 丝 生 长 ,不 利 于 孢 子 的 形 成 ,而 长 期 黑 暗 不 利 于 菌 丝 生 长 ,但 有 利 于 孢 子 的 形 成 。关 键 词 玉 米 灰 斑 病 菌 ; 振 荡 培 养 ; 产 孢 ; 二 级 分 段 培 养 法中 图 分 类 号 : S 435. 131. 4 文 献 标 识 码 : A DOI : 10. 3969/ j. issn. 052921542. 2011. 02. 035Resea rch met hodology f or maize gray leaf spot : .sp orulation of Cercospora zeae2maydisZhao Zhenglong1 , Wu Xingxing1 , Mao Zichao2 , He Yueqiu1 ,2(1. The National Center for Agricult ural Biodiversity Exploitation , Yunnan Agricult ural University , Kunming 650201 , China ;2. Faculty of Agronomy a nd Biotechnology , Yunnan Agricult ural University , Kunming 650201 , China)Abstract The p at hogen of maize gray leaf sp ot , Cercosp ora zeae2maydis , was inoculated on p otat o sucrose agar( PSA) , oat t omat o plus CaCO3 agar (O TCA) , maize leaf p owder plus CaCO3 agar ( ML PCA) , oat meal agar (OA)and crude w heat p owder agar ( CW PA) , and incubated at 25 f or measuring t he mycelial growt h , sp orulationtime and number. The results showed t hat t he mycelia grew very slow on t he media , wit h an average of 0. 33 mmp er day. They grew f astest on OA and PSA , slower on CW PA and most slowly on ML PCA . Based on t he results ,a sp orulation met hod was set up , namely two2step culturing met hod. The mycelia were inoculated int o flask wit hPS and 10 - 15 glass balls of 5mm diameter , and shaken at 25 and 180 r/ min f or 15 days , t o culture t he mycelialf ragment suspension. Then t he suspension was smeared on ML PCA medium and incubated f or about 13 days at25 wit hout light . By t his way , a large number of sp ores could be p roduced f or inoculation. L ong illuminationp romoted t he mycelial growt h , but on t he cont rary , long darkness was conducive t o sp orulation.Key words Cercosp ora zeae2maydis ; shaking culture ; sp orulation ; two2step culturing met hod玉 米 灰 斑 病 (maize gray leaf spot) 也 称 玉 米 尾孢 叶 斑 病 ,是 由 Cercos pora zeae2m ay dis Tehon 用 上 海 市 求 精 生化 试 剂 仪 器 有 限 公 司 生 产 的 25 16 规 格 的 血 球 计数 板 在 显 微 镜 下 计 量 孢 子 数 。1. 3. 3 培 养 基 对 病 菌 产 孢 量 的 影 响吸 取 0. 2 mL 菌 丝 悬 浮 液 均 匀 地 涂 布 于 PSA、O TCA、 ML PCA、 O TCA 和 CWPA 平 板 培 养 基 上 ,放 入 25 恒 温 箱 中 黑 暗 培 养 。 第 3 天 开 始 ,在 显 微镜 下 ,隔 1 d 测 培 养 基 孢 子 量 1 次 ,连 续 测 16 次 ,测量 方 法 同 1. 3. 2。2 结 果 与 分 析2. 1 病 菌 在 不 同 培 养 基 上 的 生 长 速 度玉 米 灰 斑 病 菌 菌 落 在 供 试 的 5 种 固 体 培 养 基 上生 长 速 度 均 非 常 缓 慢 , 菌 落 直 径 每 天 增 长 量 在0. 33 mm左 右 (图 1) 。 其 中 以 在 OA (0. 38 mm/ d)和 PSA (0. 37 mm/ d) 上 生 长 速 度 较 快 ,在 CWPA(0. 32 mm/ d) 和 O TCA (0. 30 mm/ d) 上 生 长 速 度 居中 ,以 在 ML PCA 培 养 基 上 生 长 速 度 最 慢 , 仅0. 28 mm/ d。 采 用 0. 2 mL 菌 丝 悬 浮 液 涂 平 板 的 方 法培 养 时 ,大 量 菌 丝 段 分 散 形 成 的 菌 落 在 第 8 天 于 5 种培 养 基 上 都 能 长 满 直 径 90 mm 的 培 养 皿 。 在 5 种 培养 基 上 ,菌 落 颜 色 有 所 不 同 。 在 O TCA 培 养 基 上 ,菌落 颜 色 最 深 ,为 灰 绿 色 ,其 次 ,按 PSA、 CWPA、 OA、ML PCA 的 顺 序 ,菌 落 的 颜 色 逐 渐 变 浅 ,在 ML PCA 上菌 落 颜 色 为 灰 白 色 。 气 生 菌 丝 在 OA 上 生 长 最 好 、 最致 密 ,其 次 是 PSA、 O TCA、 ML PCA ,CWPA 上 的 菌 丝短 且 稀 疏 。 在 PSA 和 O TCA 上 ,单 个 菌 落 独 立 地 形成 坚 硬 小 突 起 ,里 面 含 有 大 量 的 水 分 。图 1 不 同 培 养 基 上 玉 米 灰 斑 病 菌 菌 落 直 径751 1994-2016 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 20112. 2 不 同 光 照 时 间 对 病 菌 产 孢 量 的 影 响在 不 同 光 照 条 件 下 ,用 菌 丝 悬 液 在 ML PCA 上涂 平 板 的 方 法 ,检 查 产 孢 量 。 结 果 表 明 ,在 培 养 第12 天 和 第 14 天 调 查 ,全 光 照 处 理 的 灰 斑 病 菌 菌 落完 全 不 产 孢 ,只 形 成 较 多 灰 白 色 的 气 生 菌 丝 。 在 全黑 暗 条 件 下 培 养 12 d 和 14 d 后 ,每 个 培 养 皿 平 均 分别 产 生 1. 1 107 和 8. 2 106 孢 子 。 在 12 h 光 照 条件 下 ,气 生 菌 丝 多 于 完 全 黑 暗 条 件 下 的 菌 丝 ,每 皿 分别 产 生 4. 8 106 和 4. 0 106 孢 子 。2. 3 玉 米 灰 斑 病 菌 在 不 同 培 养 基 上 的 产 孢 情 况采 用 菌 丝 悬 浮 液 涂 平 板 法 ,在 O TCA、 PSA、CWPA、 OA、 ML PCA 上 检 测 灰 斑 病 菌 产 孢 情 况 ,自接 种 后 的 第 3 天 开 始 ,隔 天 检 测 产 孢 数 。 结 果 表 明 ,不 同 培 养 基 上 产 生 的 孢 子 量 存 在 显 著 差 异 , PSA 在培 养 9 d 时 ,出 现 产 孢 高 峰 ,但 与 其 他 处 理 相 比 ,孢子 量 少 ,仅 1. 89 105 个 / 皿 ; ML PCA 在 13 d 出 现产 孢 高 峰 ,孢 子 量 达 到 77. 78 105 个 / 皿 ,是 PSA培 养 基 产 孢 量 的 41 倍 ,差 异 达 极 显 著 水 平 。 ML P2CA 培 养 基 在 第 13 天 产 生 的 孢 子 量 也 极 显 著 地 高 于OA 培 养 基 的 第 25 天 的 孢 子 量 ( 24. 07 105 个 /皿 ) 。 在 CWPA 培 养 基 上 ,孢 子 产 生 的 高 峰 期 在 第23 天 才 出 现 , 产 孢 量 ( 85. 65 105 个 / 皿 ) 才 与ML PCA 上 孢 子 量 相 当 。 与 上 述 4 种 培 养 基 相 比 ,O TCA 上 产 孢 高 峰 日 出 现 时 间 更 晚 ,需 要 27 d ,其 孢子 量 (75. 00 105 个 / 皿 ) 才 与 ML PCA 的 第 13 天相 当 。 从 连 续 观 察 的 结 果 (图 2) 来 看 ,各 培 养 基 均是 在 最 大 产 孢 量 后 ,培 养 基 上 的 菌 丝 逐 渐 增 多 ,孢 子量 迅 速 下 降 。 这 可 能 与 大 量 孢 子 萌 发 ,而 培 养 基 中的 营 养 逐 渐 消 耗 殆 尽 有 关 。图 2 不 同 培 养 基 上 玉 米 灰 斑 病 菌 的 产 孢 量3 讨 论玉 米 灰 斑 病 菌 在 培 养 基 上 生 长 非 常 缓 慢 。 由 于生 长 慢 ,产 孢 所 需 时 间 长 ,在 培 养 过 程 中 易 发 生 污染 ,影 响 对 病 原 菌 的 生 物 学 、 玉 米 抗 性 鉴 定 等 研 究 。为 了 克 服 灰 斑 病 菌 生 长 慢 的 缺 点 ,研 究 者 们 常 采 用增 加 接 种 体 的 方 法 来 提 高 工 作 效 率 。 如 孢 子 悬 液 涂抹 平 板 的 方 法 ,缩 短 培 养 时 间 ,Beckman 等 8 采 用 长有 菌 落 的 琼 脂 块 捣 碎 后 ,涂 在 玉 米 叶 煎 汁 碳 酸 钙 平板 和 V8 碳 酸 钙 培 养 基 上 ,置 于 25 的 恒 温 箱 中 ,光 照 和 黑 暗 各 12 h 培 养 14 d 后 ,两 种 培 养 基 分 别 可得 到 孢 子 1. 83 105 个 / 皿 和 2. 36 105 个 / 皿 。 佟淑 杰 等 9 和 徐 秀 德 等 10 采 用 在 培 养 基 上 继 代 的 分生 孢 子 涂 布 平 板 的 方 法 ,于 25 下 培 养 5 d ,每 皿 可获 孢 子 高 达 1. 36 109 。 然 而 ,上 述 两 种 方 法 对 无 菌操 作 要 求 严 格 ,否 则 培 养 基 易 于 污 染 。 此 外 ,采 用 高粱 粒 培 养 灰 斑 病 菌 也 是 一 种 常 用 方 法 9 ,但 病 菌 在高 粱 粒 上 不 产 生 分 生 孢 子 9 ,11 ,不 能 开 展 喷 雾 接 种 ,接 种 时 只 能 将 带 菌 的 高 粱 粒 直 接 施 入 玉 米 心 叶 中 ,而 因 灰 斑 病 菌 的 潜 育 期 较 长 ,从 建 立 侵 入 关 系 到 病斑 形 成 大 量 孢 子 需 13 d 左 右 ,也 就 是 从 心 叶 上 病 斑产 生 孢 子 再 侵 染 ,往 往 需 要 较 长 时 间 ,且 发 病 不 够均 匀 ,从 而 给 玉 米 抗 性 鉴 定 带 来 困 难 。 洗 脱 田 间 病叶 上 的 孢 子 也 可 以 直 接 用 于 接 种 ,但 不 能 做 病 菌 生理 分 化 研 究 。 本 研 究 采 用 接 种 菌 丝 块 于 马 铃 薯 汁蔗 糖 培 养 基 ( PS) ,加 入 少 量 氯 霉 素 和 小 玻 璃 珠 ,振荡 培 养 。 一 方 面 在 培 养 过 程 中 可 以 直 接 观 察 液 体培 养 基 中 的 细 菌 污 染 情 况 ;另 一 方 面 加 入 了 抗 菌 素可 以 最 大 限 度 地 避 免 细 菌 污 染 ,培 养 好 的 菌 体 悬 液可 置 于 冰 箱 中 保 存 1 年 以 上 ,可 以 随 要 随 取 ,按 本研 究 每 9 cm 直 径 培 养 皿 接 种 200 L 菌 丝 碎 片 悬液 ,培 养 100 mL 菌 悬 液 ,便 可 以 接 种 500 个 培 养皿 ;第 三 是 加 入 了 玻 璃 珠 后 ,可 以 打 断 生 长 中 的 菌 丝体 ,便 于 形 成 更 多 的 生 长 点 和 易 于 用 移 液 器 取 出 与涂 抹 。 实 际 上 ,在 180 r/ min 转 速 下 ,250 mL 三 角瓶 中 加 入 100 mL 液 体 培 养 基 ,15 d 左 右 便 可 以 培养 出 粥 样 浓 稠 的 菌 丝 体 片 段 悬 液 。 如 果 以 上 述 悬 液继 代 培 养 ,则 培 养 这 种 悬 液 的 时 间 可 以 缩 短 至 8 d左 右 。 因 此 ,本 研 究 采 用 先 培 养 菌 丝 体 片 悬 液 ,再 以悬 液 涂 布 固 体 培 养 基 的 二 级 分 段 培 养 法 ,可 以 明 显提 高 玉 米 灰 斑 病 菌 培 养 效 率 。 这 种 方 法 不 仅 可 用 于玉 米 灰 斑 病 菌 的 孢 子 培 养 ,而 且 还 可 以 适 用 于 其 他在 人 工 培 养 基 上 生 长 慢 的 真 菌 。玉 米 灰 斑 病 菌 的 产 孢 速 度 和 孢 子 产 生 量 与 光 照(下 转 161 页 )851 1994-2016 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 37 卷 第 2 期 蔡 笃 程 等 :番 茄 叶 片 上 美 洲 斑 潜 蝇 幼 虫 种 群 密 度 的 零 频 率 估 计 法频 率 p0 的 最 优 回 归 模 型 为 m = 1. 322 5 ( - lnp0 ) 1. 075 9 ,理 论 抽 样 数 n = 187. 3 叶 ,利 用 该 模 型 根 据0 - 1 抽 样 得 出 的 p0值 可 有 效 地 估 计 m 值 。Gerrard2Chiang 模 型 m = a ( - ln p0 ) b被 广 泛 应用 于 一 些 体 小 的 有 害 生 物 (如 蚜 虫 、 螨 类 等 ) 种 群密 度 的 估 计 1 ,本 文 用 m 和 p0拟 合 Gerrard2Chiang模 型 和 线 性 函 数 、 二 次 函 数 、 双 曲 函 数 、 指 数 函 数 、幂 函 数 及 对 数 函 数 7 种 常 见 函 数 模 型 的 结 果 也 表明 , Gerrard2Chiang 模 型 优 于 其 他 6 种 常 见 函 数模 型 。用 零 频 率 方 法 估 计 昆 虫 田 间 种 群 密 度 ,由 于 避免 了 直 接 计 数 的 繁 琐 过 程 ,因 而 具 有 操 作 简 便 和 效率 高 的 优 点 ,但 在 应 用 时 首 先 需 满 足 理 论 抽 样 数 且尽 量 采 用 随 机 抽 样 以 保 证 抽 样 精 度 ,因 为 模 型 建 立的 基 础 是 随 机 抽 样 ;另 外 在 拟 合 m - p0 模 型 时 , m、p0数 据 最 好 有 10 20 组 或 更 多 ,以 保 证 模 型 F检 验时 有 足 够 的 残 差 自 由 度 ,另 一 方 面 用 于 计 算 m、 p0的样 本 数 不 能 过 小 ,最 好 在 100 以 上 (至 少 应 达 到50) ,以 保 证 m、 p0的 可 靠 性 。参 考 文 献1 汪 信 庚 , 刘 树 生 . 昆 虫 种 群 密 度 的 二 项 抽 样 估 计 模 型 研 究 进 展J . 生 物 数 学 学 报 , 1996 , 11 (3) : 45251.2 Hall D G , Childers C C , Eger J E. Binomial sampling to esti2mate rust mite ( Acari : Eriophyidae) densities on orange fruitJ . Journal of Economic Entomology , 2007 , 100 ( 1 ) :2332240.3 Schaalje G B , Butt s R A , Lysyk T J . Simulation studies of bi2nomial sampling : a new variance estimator and density predic2tor , wit h special reference to t he russian wheat aphid ( Ho2moptera : Aphididae) J . Journal of Economic Entomology ,1991 , 84 (1) : 1402147. 4 Eizi Kuno. Evaluation of statistical precision and design of effi2cient sampling for t he population estimation based on frequencyof occurrenceJ . Researches on Population Ecology , 1986 , 28(2) : 3052319.5 丁 岩 钦 . 昆 虫 数 学 生 态 学 M . 北 京 : 科 学 出 版 社 , 1994 :1262134.6 秦 厚 国 , 叶 正 襄 , 李 华 . 稻 茎 毛 眼 水 蝇 幼 虫 密 度 估 计 方 法 的 研究 J . 中 国 水 稻 科 学 , 1996 , 10 (3) : 1852188.7 卢 纹 岱 , 朱 一 力 , 沙 捷 ,等 . SPSS for Windows 从 入 门 到 精 通 M . 北 京 : 电 子 工 业 出 版 社 , 1997 :3182334.(上 接 158 页 )条 件 、 培 养 基 类 型 及 接 种 体 用 量 有 关 。 连 续 光 照 不利 于 孢 子 的 形 成 ,而 有 利 于 气 生 菌 丝 生 长 ,连 续 黑 暗培 养 有 利 于 孢 子 产 生 。 应 用 玉 米 叶 粉 碳 酸 钙 培 养基 10 所 需 时 间 短 ,成 本 低 ,产 生 孢 子 量 大 。 燕 麦 番茄 汁 碳 酸 钙 培 养 基 的 营 养 丰 富 ,与 燕 麦 培 养 基 相 比 ,推 迟 了 产 孢 高 峰 期 出 现 ,但 孢 子 量 几 近 是 后 者 的 3倍 。 常 用 于 真 菌 培 养 的 PSA ,尽 管 有 利 于 菌 丝 生长 ,但 其 产 孢 量 较 少 ,不 适 用 于 产 孢 培 养 基 ,这 一 结果 与 Beckman 等 8 报 道 的 PDA 相 似 。 然 而 ,它 适用 于 二 级 分 段 培 养 法 中 的 菌 丝 培 养 阶 段 ,且 成 本 低 。本 研 究 的 结 果 是 在 9 cm 直 径 培 养 皿 中 加 入 200 L第 1 阶 段 培 养 的 菌 丝 碎 片 悬 液 条 件 下 取 得 的 ,如 果适 当 增 加 接 种 体 的 数 量 ,从 涂 板 到 产 孢 的 时 间 是 否还 将 缩 短 有 待 于 进 一 步 研 究 。本 研 究 中 所 得 到 的 产 孢 量 与 Beckman 等 8 和Brunelli 等 12 相 似 ,即 每 9 cm 直 径 的 培 养 皿 可 产 生百 万 级 的 孢 子 ,与 佟 淑 杰 等 9 的 十 亿 级 的 孢 子 相 差1 000 倍 ,这 可 能 与 各 实 验 室 培 养 条 件 不 一 致 有 关 。参 考 文 献 1 Tehon L R , Daniels E. Notes on parasitic fungi of IllinoisJ .Mycologia , 1925 , 17 :2402249. 2 涂 永 海 ,沙 本 才 ,何 月 秋 . 凤 庆 县 玉 米 灰 斑 病 发 生 规 律 初 步 研究 J . 云 南 农 业 大 学 学 报 , 2007 , 22 (4) :6042607.3 李 富 华 , 吴 炯 波 , 王 玉 涛 . 玉 米 灰 斑 病 的 研 究 现 状 、 问 题 与 展望 J . 玉 米 科 学 , 2005 , 13 (3) : 1172121.4 马 荣 ,吴 景 芝 ,吴 毅 歆 ,等 . 云 南 省 区 试 玉 米 新 品 种 对 4 种 叶 斑病 的 抗 性 鉴 定 J