云南省玉米大斑病菌的RAPD分析

云南大学学报 ( 自然科学版 ) ， 2011， 33 ( 2) : 244 248 CN 53 1045/N ISSN 0258 7971Journal of Yunnan University http: /www yndxxb ynu edu cn云南省玉米大斑病菌的 RAPD 分析*王利智1， 2， 吴景芝2， 康志钰1， 何月秋1， 2( 1 云南农业大学 农学与生物技术学院 ， 云南 昆明 650201;2 云南农业大学 教育部农业生物多样性与病虫害控制重点实验室 ， 云南 昆明 650201)摘要 : 应用 7 条随机引物对采自云南省不同玉米产区的玉米大斑菌 81 个菌株的 DNA 进行了 RAPD 分析 结果表明 ， 这些菌株共产生 60 条谱带 ， 其中 43 条为多态性带 ， 占 71 7% 利用 UPGMA 法对 DNA 扩增图谱进行聚类分析 ， 以遗传距离 050 为阈值 ， 81 个菌株可分为 5 个遗传群体 ， 表明云南省玉米大斑病菌中具有丰富的种内遗传多样性 然而 ， 这种分子标记所划分的群体与菌株来源地及致病类型间没有直接关系 关键词 : 玉米大斑病菌 ; RAPD; 遗传多态性 ; 云南省中图分类号 : S 435131 文献标识码 : A 文章编号 : 0258 7971( 2011) 02 0244 05大斑突脐孢菌 Exserohilum turcicum( Pass )Leonard et Suggs 引起的玉米大斑病广泛分布在世界玉米产区 ， 是危害较重的叶部病害之一 我国于1899 年首次在东北发现玉米大斑病 1 20 世纪 70年代以来 ， 该病曾在我国西南冷凉地区 、河北及东北春玉米种植区几度发生和流行 ， 一般年份减产20%， 严重时达 50% 2 近年来 ， 玉米大斑病发生呈回升趋势 2003 年和 2004 年 ， 北方春玉米区和西南玉米区的大斑病大范围严重发生 ， 且许多品种上的病斑类型发生了变化 ， 病斑长度常常达到 3040 cm， 给玉米生产造成了严重影响 云南省玉米大斑病发生就较为普遍 ， 在部分甜质和糯质玉米上发生相当严重 ， 个别品种在抽穗前便开始死亡 然而 ， 大斑病回升的具体原因目前尚不十分清楚 ， 这可能与长期推广具有抗性基因品种所引起的病原菌生理小种变化有关 3随机扩增多态性 DNA( Random amplified poly-morphic DNA， 简称 RAPD) 的分子标记技术 ， 具有简便 、灵敏 、多态性较好等特点 ， 被广泛应用于生物多样性检测 ， 已应用于真菌种间亲缘关系 、种内不同来源群体遗传多样性和生理小种鉴别等研究 4 10 本研究采用 RAPD 技术 ， 从分子水平上测定和分析云南省不同玉米主产区的大斑病菌遗传多样性 ， 旨在为大斑病防治提供参考 1 材料与方法11 供试菌株 从云南省不同玉米主产区采集玉米大斑病病叶 ， 经组织分离 、单孢纯化获得 81 株玉米大斑病菌菌株 ( 下称大斑菌株 ) ( 表 1) 菌株的生理小种鉴定见文献 11 12 病菌 DNA 提取 采用 HE Y ( 何月秋 ) 12修改过的 CTAB 法提取病菌 DNA13 引物筛选 经反复筛选 ， 获得扩增产物带型清晰 ， 重复性好的 7 条随机引物 ( 上海生物工程有限公司合成 ) 用于 81 个菌株的 RAPD 扩增 14 RAPD 扩增 采用 25L 反应体系 ， 包含 : 10 PCR buffer 25 L; 25 mmol/L dNTP 15 L; 10mol/L 随机引物 1 L; 5 U/L Taq 酶 025 L; 模板 DNA 1 L; 双蒸水 18 75 L 反应循环参数为 :94 预变性 10 min; 扩增 94 20 s， 37 退火 30s， 72 延伸 80 s， 共 42 个循环 ; 最后 72 延伸 10min 程序结束后取出扩增产物在 1 5% 的琼脂糖凝胶中电泳 ， Marker 为 D2000+， 电泳缓冲液为 1 TAE， 电压 4 V/cm 电泳结束后 ， 在 IQuant capture* 收稿日期 : 2010 10 15基金项目 : 云南省支撑计划项目资助 ( 2006NG19) ; 云南省行业体系项目资助 作者简介 : 王利智 ( 1984 ) ， 男 ， 湖北人 ， 硕士生 ， 主要从事种子病理方面的研究 通讯作者 : 何月秋 ( 1956 ) ， 男 ， 湖北人 ， 教授 ， 主要从事植物病理学方面的研究 ， E mail: ynfh2007163 com紫外凝胶成像系统上观察 ， 保存图像 表 1 2007 2009 年云南省 81 株玉米大斑病菌采集地点Tab1 Eighty one Exserohilum turcicum isolates collected from Yunnan Province during 2007 to 2009菌号 来源地 小种 菌号 来源地 小种1 临沧市临翔区凤翔街道南信桥 23N 42 保山市隆阳区瓦马乡岩脚岩箐村 23N2 临沧市临翔区南美乡南美村 0 43 保山市隆阳区辛街乡大官市村 23 凤庆县凤山镇后山 12N 44 施甸水长乡小官市村 2N4 南涧县碧溪乡回龙山村 123N 45 德宏州农科所 123N5 南涧县南涧镇太平村 0 46 德宏州农科所 123N6 永平县博南镇胜泉村 0 47 瑞丽市勐卯镇勐嘎村 27 大理市三塔银桥镇 1 48 瑞丽市畹町镇混板村 12N8 大理市三塔银桥镇 23 49 瑞丽市姐告办事处 129 大理市三塔银桥镇 123N 50 瑞丽市畹町镇 010 宾川县宾居镇 12N 51 瑞丽市畹町镇 123N11 彝良县洛泽河镇邻东村 23N 52 陇川县护国乡护国村 212 彝良县洛泽河镇邻东村 123N 53 芒市遮放镇 123N13 彝良县洛泽河镇邻东村 23N 54 芒市弄欢镇 23N14 昭通市昭阳区沙坝八社 3N 55 芒市弄欢镇 123N15 昭通市昭阳区沙坝七社 123N 56 陇川县户撒乡保平村 1216 镇雄县乌峰旧府关房 2 57 陇川县户撒乡芒柄村 123N17 镇雄县乌峰旧府关房 12 58 梁河县芒东镇 318 砚山县江娜镇 123N 59 梁河县芒东镇 12N19 麻栗坡县城北社区 123N 60 金平县营盘乡 123N20 文山县追栗街乡 123N 61 金平县铜厂乡 3N21 文山县追栗街乡 12 62 金平县铜厂乡 2N22 普洱市郊 23 63 开远市乐白道办事处 123 墨江县联珠镇赖蚌村 12N 64 开远市小龙潭办事处 12N24 墨江县联珠镇廉路村 2N 65 开远市乐白道酒房村 12N25 墨江县双龙乡 123N 66 开远市平街乡宗舍村 326 玉溪市红塔区高仓镇龙树村 23 67 开远市平街乡宗舍村 12N27 通海县高大乡普丛村 23N 68 开远市中和营镇坝心村 2328 通海县高大乡五街村 23N 69 个旧市锡城镇水塘寨村 2329 通海县高大乡五街村 0 70 昆明云南农业大学农场 130 通海县高大乡五街村 1 71 禄劝县撒营盘镇 12N31 通海县高大乡五街村 123N 72 禄劝县团街镇 23N32 通海县河西镇代文村 1 73 禄劝县团街镇 12N33 通海县河西镇代文村 123N 74 禄丰县金山镇南雄三棵树 234 峨山县小街镇 123N 75 禄丰县金山镇南雄三棵树 035 峨山县双江镇高平村 3N 76 禄丰县金山镇南雄三棵树 123N36 峨山县小街镇 0 77 楚雄市富民镇富民村 037 玉溪市北城 0 78 会泽县乐业镇 23N38 保山市隆阳区板桥镇老营村 123N 79 富源县中安镇太和村 039 保山市隆阳区板桥镇老营村 23N 80 富源县大河镇白马村 12N40 施甸县水长乡兵斗村 12N 81 永胜县永北镇黎明村 12N41 施甸县姚关大马邑 2N542第 2 期 王利智等 : 云南省玉米大斑病菌的 RAPD 分析15 数据统计分析 将每条 RAPD 条带均看作一个遗传位点 ， 不同长度的 DNA 片段在样品中出现赋值 “1”和不出现赋值 “0”， 构建 “1， 0”数据表 依据 NTMAS 中的 Jaccard 公式计算各菌株间的遗传相似系数 ( Gs) ， 应用非加权组平均法 ( unweightedpair group method with arithmetic means， UPGMA)进行聚类分析 ， 以 NTSYSpc version 2 2 程序运算建立聚类图 2 结果与分析21 RAPD 扩增图谱分析 最终选定的 7 条引物分别对 81 个大斑菌株扩增的条带数为 7 10 条 ，扩增片段的分子量为 100 3 000 bp， 共 43 个多态性 DNA 标记条带 ， 多态性条带占 71 7%， 表明供试玉米大斑菌株群体具有较丰富的遗传多样性( 表 2) 从引物 S226 扩增的图谱 ( 图 1) 可以看出 ， 目标菌株被扩出 3 条具有特异性条带 ， 但少部分菌株只能被扩增出 1 或 2 条带 ， 且带型为非特异性条带 引物 S160 只扩增 2 条较清晰的特异性条带 ( 图2) ， 其余均为非特异性的多态性条带 其他引物扩增出的条带模式图从略 22 供试大斑菌株间的相似性及聚类结果 供试的 81 个大斑菌株遗传相关系数在 033 10 之间表 2 7 条引物扩增玉米大斑病菌 DNA 条带数Tab 2 Bands of amplified Exserohilum turcicum DNA with7 primers引物 5 3序列 扩增带数 多态性带数S30 GTGATCGCAG 9 6S154 TGCGGCTGAG 7 4S160 AACGGTGACC 9 7S226 ACGCCCAGGT 8 5S2027 GAAGGCTGGG 9 8S2034 GTGGGACCTG 8 5S2035 AAGTGCCCTG 10 8Total 60 43( 图 3) ， NTSYS 聚类图在 050 的相似水平下 ， 可分为 5 个遗传群体 第 1 群体包括 1， 3， 16， 26， 31， 34等 29 个菌株 ; 第 2 群体包括 7， 8， 9， 10 等 31 个菌株 ; 第 3 群体包括 4， 5， 55 等 12 个菌株 ; 第 4 群体包括 20， 25， 21， 24 等 4 个菌株 ; 第 5 群体包括 6，33， 40， 24 和 60 共 6 个菌株 在 0 67 的相似水平下 ， 供试 81 个菌株可分为 12 个遗传群体 ; 在 0 83的相似水平下 ， 可分为 30 个遗传群体 图 1 引物 S226 扩增的 RAPD 图谱Fig 1 RAPD patterns of E turcicum amplified by primerS226图 2 引物 S160 扩增的 RAPD 图谱Fig 2 RAPD patterns of E turcicum amplified by primerS160642 云南大学学报 ( 自然科学版 ) 第 33 卷图 3 供试玉米大斑菌株的 RAPD 聚类分析图Fig3 Clustering analysis of E turcicum isolates by RAPD technique在 0 67 相似水平下 ， 临沧的 2 个菌株 ( 1， 2号 ) 被划分于 2 个遗传群体中 ; 在 0 50 相似水平下 ， 大理的 8 个菌株 ( 3 10 号 ) 被划分于 4 个遗传群体中 ; 大理的 3 号菌株 、昭通的 16 号菌株和玉溪的 26、31 号菌株的遗传背景几乎相似 可见 ， 供试的玉米大斑病菌群体的划分与不同地理来源无直接的关系 ， 即未表现出来自同一个地区的所有菌株同时被划分到同一组群内的现象 在 050 阈值下 ，10 个 0 号生理小种 ( 2， 5， 6， 29， 36， 37， 50， 75， 77，79 号 ) 分属于 4 个遗传群体 ; 5 个 1 号小种 ( 7， 30，32， 63， 70 号 ) 分属于第 1， 2， 3 三个遗传群体中 ; 5个 2 号小种 ( 16， 21， 43， 47， 74 号 ) 分属于第 1， 2， 4三个遗传群体中 ; 2 个 3 号小种 ( 58， 66 号 ) 分属于第 3 遗传群体中 ; 18 个 123N 号小种分属于 5 个遗传群体中 由此可见 ， RAPD 划分遗传群体与生理小种间没有直接关联 3 讨 论依据 RAPD 技术 ， 结合遗传距离的聚类图分析 ， 比较了云南省 13 个地州的 81 株玉米大斑病菌间的遗传亲缘关系 ， 这些菌株按照不同的相似率可划分为不同的遗传群体 ， 在 DNA 水平上证明了云南省玉米大斑病菌中具有丰富的种内遗传多态性 从菌株来源区域来看 ， 菌株的遗传群体与区域来源间没有直接关系 ， 即同一玉米产区内菌株的遗传背景存在差异 ， 不同玉米产区菌株也可划分为同一遗传群体 这一研究结果与张明会 5等对我国不同省份大斑病菌研究结论一致 ， 但该文中仅有 1 个云南的菌株 ， 未能反映云南玉米大斑病菌遗传多样性整体情况 前文报道 11， 云南玉米大斑病菌可分为0， 1， 2， 3， 12， 23， 2N， 3N， 12N， 23N 和 123N 等 11 个小种 ， 即该病菌致病能力也存在较大差异 ， 这种致病力差异一定是受遗传基因控制的 ， 但 RAPD 指纹技术划分的遗传群体与致病小种间没有直接关联 ，即相同小种的菌株在同一阈值下分属于不同遗传群体中 这可能是由于 RAPD 标记是一种中性标记 ， 它与病菌的致病性或无毒特性没有直接关系 但 RAPD 技术证明云南省玉米大斑病菌组成复杂的结论是正确的 可见 ， 云南省的玉米大斑病菌群体的遗传背景已呈现复杂化和多态性 ， 这也许与多年来不同抗病品种的推广以及环境的变化和田间的耕作制度有关 ， 导致病原菌不断变异 、小种多样性增加 云南省玉米大斑病菌遗传背景的复杂化 ，应引起玉米育种者的注意 ， 在利用本地玉米种质资源同时 ， 应扩大或引进更优良的种质资源 ， 从而拓宽玉米遗传基础 ， 为玉米抗大斑病育种奠定更为坚实的基础工作 参考文献 : 1 WINDES J M， PEDERSON W L An isolate of Exserohi-742第 2 期 王利智等 : 云南省玉米大斑病菌的 RAPD 分析lum turcicum virulent on maize inbreds with resistanceHtN J Plant Dis， 1991， 75( 7) : 430 2 孙淑琴 ， 温雷蕾 ， 董金皋 玉米大斑病菌的生理小种及交配型测定 J 玉米科学 ， 2005， 13( 4) : 112-113 3 王晓鸣 ， 晋齐鸣 ， 石洁 ， 等 玉米病害发生现状与推广品种抗性对未来病害发展的影响 J 植物病理学报 ， 2006， 36( 1) : 1-11 4 BORCHARDT D S， WELZ H G， GEIGER H H Molecu-lar marker analysis of European Setosphaeria turcicapopulations J European Journal of Plant Pathology，1998， 104( 6) : 611-617 5 张明会 ， 徐秀德 ， 姜钰 ， 等 玉米大斑病菌种群遗传多样性研究 J 玉米科学 ， 2009， 17( 1) : 143-146 6 窦艳萍 ， 金庆超 河南省玉米弯孢叶斑病菌遗传多样性的 RAPD 分析 J 西北农业学报 ， 2007， 16( 3) :244-247 7 ABADI R， Perl Treves R， LEVY Y Molecular variabil-ity among Exserohilum turcicum isolates using RAPD( random amplified polymorphic DNA) J CanadianJournal of Plant Pathology， 1996， 18: 29-34 8 BORCHARDT D S， WELZ H G， GEIGER H H Geneticstructure of Setosphaeria turcica populations in tropicaland temperate climates J Phytopathology， 1998， 88:322-329 9 桂秀梅 玉米大斑病菌遗传多态性与有性态诱导 D 保定 : 河北农业大学 2002 10 桂秀梅 ， 张金林 ， 董金皋 ， 等 玉米大斑病菌 RAPD分析最佳反应体系的建立 J 河北农业大学学报 ，2005， 28( 1) : 56-58 11 王利智 ， 康志钰 ， 吴景芝 ， 等 云南省玉米大斑病菌生理小种初步鉴定及交配型测定 J 华中农业大学学报 ， 2011( 已接受 ) 12 HE Y An improved protocol for fungal mycelium cul-ture and DNA preparation J Mycosystema 2000， 19( 3) : 434Phylogenetic analysis on Exserohilum turcicum isolatesfrom Yunnan province by RAPDWANG Li-zhi1， 2， WU Jing-zhi2， KANG Zhi-yu1， HE Yue-qiu1， 2( 1 Faculty of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;2 Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests and Diseases Co