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第4O卷第12期 2012年12月 西北农林科技大学学报(自然科学版) Journal of Northwest A&F University(NatSciEd) Vo14O No12 Dec2O12 网络出龌时间:20121119 16:46 网络出版地址:http:wwwcnk1netkcmsdetan611390S201211191646025html 多糖对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究 沈小英,牛小义,段军娜,刘 伟,宋 双,安德荣 (西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌71210O) 摘 要 【目的】筛选对烟草花叶病毒(TMV)有良好抑制作用的多糖。【方法】采用半叶法,测定了云芝、金 针菇、姬松、杏鲍菇、双孢蘑菇、灵芝、猪苓菌、蜜环菌、黑木耳、虫草、白桦茸和平菇等12种真菌多糖在枯斑三生烟 (Nitcotiana tabacum varSamsun NN)上对TMV的抑制作用,并测定了其对烟草(普通烟NC一89)生长的影响。【结 果】云芝多糖、猪苓菌多糖、虫草多糖和蜜环菌多糖对TMV均有较好的抑制效果,其中1 gL云芝多糖对TMV具有 良好的预防作用,提前48 h多糖处理的预防效果高达9212。云芝多糖对烟草具有促生作用,1 gL云芝多糖处理 烟苗的地上部鲜质量和最大叶面积增效最为显著,分别较对照提高3O98 和1974 。田间小区试验表明,经云芝 多糖处理后,NC一89烟株健壮整齐,烟叶浓绿光滑,茎围、最顶部叶片面积、产量及上中等烟比例均有所增加,其中1 gL云芝多糖处理烟株的最顶部叶面积、茎围和上中等烟比例分别较对照增加1351 ,988 和l72O 。【结论】 云芝多糖能有效抑制TMV,并可促进烟苗生长,提高烟叶产量及品质。 关键词云芝多糖;烟草花叶病毒;抑制作用;促生效应;烟叶品质 中图分类号$43572;$4822 92 文献标志码A 文章编号 16719387(2012)120115一o6 Inhibition of pOIysaccharides on tobacco mosaic virus SHEN Xiaoying,NIU Xiaoyi,DUAN Junna,LIU Wei,SONG Shuang,AN Derong (College of Plant Protection,State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, NorthwestA&F University,gangling,Shaanxi 712100,China) Abstract:Obj ectiveThis study aimed to filter out the po1ysaccharides that can inhibit tobacco mosa ic virus(TMV)effectivelyMethodThe inhibiting effects and effects to tobacco growth of 1 2 polysac charides to TMV on Nitcotiana tabacum varSamsun NN were detected by half leaf methodThe 1 2 kinds of p01ysaccharides were Coriolus versicolor polysaccharide(CVP),Velutipes polysaccharide,Agaricus BlazeiMurill polysaccharide,Eryngii polysaccharide,Bisporus polysaccharide,Ganoderma lucidum poly saccharides,Polyporus polysaccharide,Armillaria po1ysaccharides,Auricularia auricular polysaccharides, Cordyceps polysaccharide,Birch velvet polysaccharides and Ostreatus polysaccharideResultIt was con firmed that Coriolus versicolor polysaccharide,Polyporus polysaccharide,Armillaria polysaccharides and Cordyceps polysaccharide had very good deactivating and preventing effects on TMVThe inhibition effects of CVP that was inoculated after being treated for 48 h reached 9212 cvP improved the growth of to baccoFresh weight of plants above ground and maximum leaf area of tobacco seedlings dealt with 1 gL CVP increased by 3098 and 1974 ,respectivelyThe field plot experiments showed that the NC一89 treated with CVP had robust and neat plants,dark green and smooth leaves and the plant height,stem circ一 收稿日期 基金项目 作者简介 通信作者 Z0lZ一04一l8 国家烟草专卖局科技重点项目(110201002024);国家“863”计划重点项目(2007AA021503);高等学校学科创新引智计 划项目(B07049) 沈小英(1986一),女,广西北海人,在读硕士,主要从事微生物资源利用研究。Email:sxm20060306sinacorn 安德荣(1963-),男,陕西大荔人,教授,博士生导师,主要从事微生物资源利用和植物病理学研究。 Email:anderong323163corn 116 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第4O卷 umference,yield and the ratio of superior tobacco all increasedWith the treatment of 1 gI CVP,the area of top of plants,stem circumference,and the ratio of superior tobacco increased by 988 ,1351 and 1 720 ,respectivelyConclusionl CVP can effectively inhibit TMV,promote seedling growth,and in crease the yield and quality of tobacco Key words:CVP;TMV;inhibition;growthpromoting;tobacco quality 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV) 是世界范围内普遍发生的一种可侵染22科198种 植物的病毒,烟草和蔬菜感染后造成品质和产量下 降,甚至绝收,给农业生产带来了严重的经济损 失。 真菌多糖是大型真菌子实体、菌丝体中由醛基 和酮基通过糖苷键连接多个单糖构成的高分子聚合 物。真菌多糖资源丰富、无毒副作用,而且易被微生 物降解、对环境无污染I2,使其有望成为最具开发前 景的药物新资源。云芝(Coriolus versicolor)又称 彩绒革盖菌,隶属担子菌亚门。云芝多糖是云芝提 取物中的主要活性成分,分子质量在131O 以 上,是含有l3(13)和J3(16)糖苷键的葡聚糖 。 云芝多糖具有的抗肿瘤、免疫增强和保护肝脏作用 已在医学研究中得到验证,有报道指出,真菌多糖通 过抑制病毒吸附、干扰病毒复制和提高机体免疫力 等途径达到抑制人体病毒病的目的 _6l。Collins 等 研究发现,云芝多糖不但能抑制人类免疫缺陷 病毒1型(HIV一1)与宿主细胞结合,而且可显著抑 制HIVl的逆转录酶活性,从而抑制该病毒的复 制。目前有关真菌多糖在植物病害防治上应用的相 关研究还比较少。张超等_8研究表明,平菇多糖、金 针菇多糖和香菇多糖对TMV和CMV均有显著抑 制效果。吴艳兵等 发现,毛头鬼伞多糖对TMV 具有较强的体外钝化及抑制侵染复制的作用,可有 效预防TMV病毒病。 为了筛选得到对烟草花叶病毒(TMV)具有显 著作用的真菌多糖,本研究用半叶法测定了云芝、金 针菇、姬松、杏鲍菇、双孢蘑菇、灵芝、猪苓菌、蜜环 菌、黑木耳、虫草、白桦茸和平菇等12种多糖对 TMV的抑制作用,并测定了其对烟草(普通烟NC一 89)生长的影响,旨在为真菌多糖在植物病害防治中 的应用提供参考依据。 1材料与方法 11 材 料 111 供试多糖金针菇多糖(Velutipes polysac charide)(4782 )、姬松茸多糖(Agaricus Blaze iMurill polysaccharide)(4937 )、云芝多糖(Co riolus versicolor polysaccharide)(436O )、杏鲍菇 多糖(Eryngii polysaccharide)(5802 )、双孢蘑菇 多糖(Bisporus polysaccharide)(5473 )、灵芝多 糖(Ganoderma lucidum polysaccharides)(6644 )、 猪苓菌多糖(Polyporus polysaccharide)(68O0 )、 蜜环菌多糖(Arrnillaria po1ysaccharides)(6560 )、 黑木耳多糖(Auricularia Auricular polysacchar ides)(6050 )、虫草多糖(Cordyceps polysaccha ride)(4906 )、白桦茸多糖(Birch Velvet polysac charides)(5669 )、平菇多糖(Ostreatus polysac charide)(5268 )等12种多糖,均由本实验室提 取、制备和纯化,并于铝箔袋密封室温保存备用。 112供试作物 枯斑三生烟(Nitcotiana taba CUTFt varSamsun NN)、普通烟NC一89(Nitcotiana tabacum varNC89),由陕西省烟草研究所提供。 所用育苗物质经消毒后,于防虫温室内种植,待枯斑 三生烟长至7-8叶期使用。 113供试病毒烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),由西北农林科技大学植物保护学院 病理实验室保存于防虫温室中的普通烟上。制备供 试病毒接种液_l。_时,取1 g TMV感病叶片,加少量 石英砂,于10 mL PBS溶液中研磨成匀浆,纱布过 滤,无菌水稀释至100 mL备用。 12抗病毒多糖的筛选 121 对TMV的体外钝化效果 选取7叶期长 势一致的枯斑三生烟,打顶,留34片叶,培养l 周。将50 mL稀释为05,1,2 gL的12种多糖液 与等量供试病毒接种液混合,静置30 min后,用半 叶法摩擦接种到烟叶半叶上,对照摩擦接种清水与 供试病毒液混合物。然后于温室中培养,每处理3 株,重复3次。待出现典型枯斑症状后统计枯斑数, 计算钝化效果: 钝化效果一(处理半叶枯斑数一对照半叶枯斑 数)对照半叶枯斑数100 。 122 对TMV的预防效果 将稀释为05,l,2 gL的l2种多糖液分别喷施到7叶期枯斑三生烟 烟叶半叶,另半叶为喷清水的对照。于喷施处理 第12期 沈小英,等:多糖对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究 1l7 24,48 h后,对各处理烟叶全叶摩擦接种病毒液。 然后于温室中培养,待出现典型枯斑症状后统计枯 斑数,计算预防效果: 预防效果一(处理半叶枯斑数一对照半叶枯斑 数)x照半叶枯斑数100。 123 对TMV的治疗效果 将供试病毒接种液 摩擦接种到7叶期枯斑三生烟烟苗叶全叶,分别于 处理24,48 h后,将稀释为05,1,2 gL的12种多 糖液喷施到处理烟叶半叶,另半叶为喷施清水对照。 然后于温室中培养,待出现典型枯斑症状后统计枯 斑数,计算治疗效果: 治疗效果一(处理半叶枯斑数一对照半叶枯斑 数)对照半叶枯斑数100 。 13 多糖对烟草生长及品质的影响 131 多糖对烟草生长的影响 在抗病毒多糖筛 选试验的基础上,选择抗病毒效果良好的多糖,稀释 为05,1,2 gL的溶液,采用温室盆栽法测定其对 烟草生长的影响 。 将灭菌后的土及基质混匀分装于高75 cm、口 径70 cm的陶钵中,每钵200 g。选择生长整齐的 45叶期普通烟NC一89幼苗进行移栽,缓苗7 d 后,叶面喷施供试多糖液,以清水为对照。此后再连 续喷施2次多糖液,每次间隔10 d。每处理重复3 次,每重复处理3株幼苗,于最后1次喷施处理5 d 后测定烟苗的株高、叶片数、茎围、地上部鲜质量及 最大叶片面积。 132 多糖对烟叶产量及品质的影响 小区试验 设025,05,1 gL 3个云芝多糖处理水平,以清水 为对照,每处理重复3次。每小区面积约40 1TI。,行 距株距一120 Ill_055 m。分别于移栽后2O,30 和40 d进行叶面喷施多糖液处理,其他农事操作均 为一致的常规操作1引。现蕾打顶后定株、定位测量 株高、有效叶片数、最顶部烟叶面积、茎围、整齐度, 统计产量、上中等烟比例_】 。引。按下式计算烟叶单 叶面积(rn ): 烟叶单叶叶面积一0634 5叶长叶宽。 14数据处理 试验数据采用SPSS 120软件进行邓肯氏复极 差检测法分析与处理。 2结果与分析 21抗病毒多糖的筛选 从表1可以看出,12种供试多糖处理对TMV 的钝化效果均不明显,除2 gL云芝多糖的钝化效 果可达7613 外,其余处理的钝化效果均低于 65;12种供试多糖对TMV的预防效果均比较 好,其中以喷施多糖液48 h后接毒处理的预防效果 最好,云芝多糖、虫草多糖、蜜环菌多糖和猪苓菌多 糖喷施48 h后接毒处理的预防效果均达85 以上, 特别以1 gL云芝多糖处理的预防效果最佳,高达 9212 ,其次为2 gL的虫草多糖处理;12种供试 多糖对TMV的治疗效果较预防效果差(图1-A), 其治疗效果均低于6O 。同时,不同时间云芝多糖 处理叶片对TMV的预防效果有明显差异,提前48 h云芝多糖处理(图l-C)叶片对TMV的预防效果 明显好于提前24 h处理(图1一B)。另外,多糖质量 浓度及处理方式均对抑制效果有一定的影响。 表1 12种供试多糖对TMV的抑制效果 Table 1 Inhibitory effects of 1 2 kinds of trial po1ysaccharides to TMV on tobacco 120 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第4O卷 表3 云芝多糖对普通烟NC 89大田生长性状、产量及上中等烟比例的影响 Table 3 Effects of CVP with different concentrations on the agronomic traits,yield per plot and proportion of superior and middle tobacco 3结论与讨论 烟草花叶病毒(TMV)是一种绝对内寄生的病 原物,依赖寄主细胞提供的场所、底物和酶等一系列 物质进行自我复制和装配ll。 。因此,筛选获得可 防治该病害的高度选择性化学农药非常困难。真菌 多糖通过诱发植物抗性、激发植物免疫力达到防治 植物病毒病的目的,而且具有良好的环境兼容性,在 病害防治方面具有良好的应用前景_2 。本试验结 果表明,云芝多糖、灵芝多糖、虫草多糖和蜜环菌多 糖对TMV均具有一定的抑制效果,且以云芝多糖 的预防效果最为显著,用1 gL云芝多糖预先处理 48 h,其对TMV的预防效果可达9212 ;云芝多 糖还可促进烟苗生长,经云芝多糖处理的烟苗烟株 健壮整齐,烟叶浓绿光滑。大田试验表明,普通烟 NC一89幼苗经05,1 gL云芝多糖处理后,烟株的 株高、最顶部叶面积、茎围、小区产量和上中等烟比 例均有所提高,其中以1 gL云芝多糖处理烟株的 上中等烟比例增加最为显著,较对照提高1720。 因此,云芝多糖在烟草花叶病毒病的防治方面具有 良好的开发前景。 参考文献 1 McGrath M T,Shishkoff NEvaluation of biocompatible prod ucts for managing cucurhit powdery mildewJCrop Protect, 1 999,l8:471 478 2 李玲艳,包海鹰云芝的化学成分及药理活性研究概况J菌 物研究,201l,9(3):180185 I i I Y。Bao H YSummarization of researches on chemical compositions and pharmacological activities of Coriolus versi colorJJournal of Fungal Research,2011,9(3):180185(in Chinese) 3葛玉,肖 红,张欣,等真菌多糖的研究开发现状J食 品研究与开发,2005,26(1):2325 Ge Y,Xiao H,Zhang X,et a1Research status of the fungal polysaccharideJFood Research and Development,2005,26 (1):23 25(in Chinese) 4 5 6 7 8 E9 1O 11 Ng T BA review of research on the proteinbound polysaccha ride(p0】ysaccharopeptjde,PSP)from the mushroom Coriolus versicolor(basidiomycetes:polyporaceae)JGeneral Phar macology:The Vascular System,1998,30(1):1-4 Harhaji I J,Mijatovic S,MaksimovicIvanic D,et a1Antitum or effect of Coriolus versicolor error:Figure isnt in document methanol extract against mouse B1 6 melanoma ceils:in vitro and in vivo 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