云南省区试玉米新品种抗性鉴定与RGA分析

第31卷第2期 2009年4月 江西农业大学学报 Acts Agriculturae Universitatis Jiangxiensis Vo131，No2 Apr，2009 文章编号：10002286(2009)02020806 云南省区试玉米新品种抗性鉴定与RGA分析 马 荣 ，吴景芝 ，沙本才2，吴毅歆 ，何月秋 (1云南农业大学教育部生物多样性与病虫害控制重点实验室，云南昆明650201；2云南农业大学农学与生物 技术学院，云南昆明650201) 摘要：2006年和2007年人工接种鉴定云南省区域试验42份新品种对灰斑病、大斑病(northern leaf blight， NLB)、小斑病(southern leaf blight，SLB)、弯孢霉叶斑病(Curvularia leaf spot，CLS)、纹秸病(sheath blight，SB)、 茎腐病(stem rot，SR)、穗腐病(ear rot，ER)、丝黑穗病(head smut，HS)、锈病(rust)等9种玉米病害的抗性，仅 海974能兼抗7种病害，占238。7个品种兼抗6种病害，占1667。13份品种兼抗5种病害，占3096。 能兼抗5种以上病害的品种共20份，占总数的4762。采用抗病基因类似序列(resistance gene analogue， RGA)分析，可把这42份品种划分为6个类群。第1类群，对弯孢霉叶斑病、丝黑穗病表现出抗性；第2类群， 对灰斑病、丝黑穗病表现抗性；第3类群对弯孢霉叶斑病、茎腐病、丝黑穗病表现抗性；第4类群，对丝黑穗病、 大斑病、小斑病表现抗性；第5类群对弯孢霉叶斑病、大斑病、小斑病病表现抗性；第6类群对大斑病、小斑病表 现抗性。 关键词：玉米；抗性鉴定；抗病基因类似序列分析 中图分类号：$513034 文献标识码：A Disease Resistance Identification and RGA Analysis of New Maize Cultivars in Yunnan Regional Test MA Rong ，WU Jingzhi ，SHA Bencal，WU Yixin ，HE Yueqiu (1Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control，Ministry of Education，Yunnan Agri cultural University，Kunming 650201，China；2College of Agronomy and Biotechnology，Kunming 650201， China) Abstract：In 2006 and 2007。42 new cultivars in tl1e regional test in Yunnan were identified for tlleir re sistances to gray leaf spot(GLS)，northem leaf blJlght(NLB)，southelTl leaf blight(SLB)，Curvularia leaf spot(CLS)，sheath blight(SB)，stem rot(SR)，ear rot(ER)，head smut(HS)and rust by artificial inocula tionHal 974(238)was resistant to 7 diseases，7 cultivars(1667)to 6 diseases，13 cuhivars(30 96)to 5 diseases，20 eultivars(4762)to more than 5 diseasesBy using RGA data，the 42 cultivars were clustered into 6 groupsGroup 1 was resistant to CLS，NLB，SLB and HS；Group 2 to GLB，NLB，SLB and HS；Group 3 to CLS，NLB，SLB，SR and HS；Group 4 to HS，NLB and SLB；Group 5 to CLS，NLB and SLB and Group 6 to NLB and SLB Key words：maize；disease resistance identification；resistance gene analogue analysis 收稿日期：20081112 修回日期：20081229 基金项目：云南省科技支撑计划项目(2006NG19) 作者简介：马荣(1983一)，女，助教。主要从事植物病害研究，Email：marong一1983163corn； 通讯作者：何月 秋，教授，Email：heyueqiuyahooeom。 第2期 马荣等：云南省区试玉米新品种抗性鉴定与RGA分析 玉米(Zea mays L)是世界上主要粮食作物和重要饲料作物，在食物供给、畜牧业和工业上具有举 足轻重的地位。在云南，玉米常年种植面积为100120万hm ，是种植面积最大的作物，占全省粮食总 产的28。然而，近年来，玉米灰斑病等病害造成玉米减产和品质下降。抗病品种的选育是解决这一 难题的关键，传统育种技术在作物遗传改良方面取得了显著成就，但由于其选择效率较低、周期较长， 已不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。利用基因组学和生物信息学的最新研究成果，开展玉米 分子标记育种，选育高产、优质、多抗新品种，已经成为玉米育种的重要研究方向。 抗病基因类似序列(resistance gene analogue，RGA)分析法是利用抗病产物具有保守结构域的特性， 通过人工合成简并引物，以植物基因组DNA或cDNA为模板进行PCR扩增，从植物中分离结构上与抗 病基因类似的序列；以该PCR产物为探针，进行RFLP等分析，开展抗病基因克隆或依据扩增条带进行 聚类分析，研究植物品种间的与抗性相关的遗传背景。该方法具有统计功效强、应用广、DNA用量少、 费用低和操作简单等优点，适合我国现阶段抗病育种相关研究_2 J。 本文旨在鉴定云南省玉米区域试验新品种对大斑病(northern leaf blight，NLB)、小斑病(southelTl leafblight，SLB)、弯孢霉叶斑病(Curvularia leafspot，CLS)、灰斑病(gray leaf spot，GLS)、锈病(rust)、纹 枯病(sheath blight，SB)、穗腐病(ear rot，ER)、茎腐病(stem rot，SR)、丝黑穗病(head smut，HS)等9种病 害的抗性，在此基础上，采用RGA条带分析42份新品种与抗病性相关的片段及其多态性，开展聚类分 析，以便为种植和选育抗病品种提供理论依据。 1 材料与方法 11品种与田间管理 42份供试品种(表2)均由云南省农业厅种子站提供。所有品种于雨季的5月中旬播种于云南农 业大学农学与生物技术学院试验地。试验地前茬为小麦，土质为红沙壤土，水肥条件良好。针对不同病 菌接种的植株分别播9套。各品种重复3次，随机区组排列。行距为40 cm，株距为30 am，小区间距为 30 am，试验地四周种植保护行2行。每小区每行种植1个品种，留l0株苗。除氮肥量略有增加外，其 他田间管理同常规。 12供试菌株与病害调查 灰斑病菌(Cercospora zeaemaydis)采自云南省屏边县和平乡，大斑病菌(Exserohilum turcicum)和小 斑病菌(Bipolaris maydis)采自蒙自县城关，茎腐病菌(Fusarium graminearum)来自大理的洱源县病株， 纹枯病菌(Rhizoctonia solani)来自云南省牟定县，锈病菌为田间自然发生的菌源。弯孢霉叶斑病菌 (Curvularia lunata)、穗腐病菌(Fusarium graminearum)由河北农科院植保所马平研究员惠赠，玉米丝黑 穗病(Sphacelotheca reiliana)由甘肃省农科院植保所郭满库研究员惠赠。菌种的扩繁、接种时期、接种方 法、病害的调查时间、调查方法见参考文献 J。根据中华人民共和国农业行业标准玉米抗病虫 性鉴定技术规范(2002) 的分级标准，对各品种抗病性做出评价。 13玉米品种的RGA分析 玉米DNA的提取采用CTAB法 J。简并引物序列由上海生物工程有限公司合成(表1)。PCR反 应共36个循环，每个循环程序包括94变性50 s，45 oC退火1 min，72延伸2 min。首次循环前先 在94预变性4 min，最后一次循环在72延伸10 min。反应结束后在4下存放。PCR反应体系、 电泳和银染方法参照Chen-9 J。以l和0分别表示抗病基因同源序列扩增片段的有和无。使用Popgene 软件程序进行玉米品种聚类分析，得出抗性相关系数。相关系数比较大，说明品种间抗性分化比较强， 即不同品种对同一种病害的抗、感性表现明显，是对田间鉴定结果的最好验证。 2 结果与分析 21玉米品种的抗病性 于2006年和2007年10月中旬逐株调查，以最严重的植株为评价抗性的主要依据，兼顾3个重复 的病级平均数，评价各品种对灰斑病、大斑病、小斑病、弯孢霉叶斑病、纹枯病、茎腐病、穗腐病、丝黑穗 病、锈病的抗性(表2，表3)。在所有供试的42份品种中，没有筛选出能同时抵抗9种病害的品种。但 210 江西农业大学学报 第31卷 发现了能兼抗7种病害的品种海974，占238。兴黄单892、西山99、金银818等6个品种兼抗6种 病害，占1429。奥试3326、DH3834、HK5824、承241等l3份品种兼抗5种病害，占3096。德玉6 号、蠡试2403、TY10333等21份品种能兼抗5种以上病害，占总数的50。云南省灰斑病正在上升为 主要病害，在局部地区已成为限制稳产的关键因素。在鉴定的42份材料中，宁玉507、ND128、路单7号 等11份品种对灰斑病表现为抗病和中抗，占2619；对大斑病、小斑病、锈病和丝黑穗病病抗性较好， 中抗以上的品种分别达39份、39份，36份和29份，占9286、9286、8571和6905；对于玉米 弯孢霉叶斑病的抗性一般，中抗水平的品种15份，占3571；对穗腐病、纹枯病和茎腐病的抗性较差， 中抗以上的品种分别为3份、2份、5份，占714、476、119。 表1抗病基因类似序列引物及其序列 Tab1 Resistance gene analogue(RGA J primers and their sequences 表2供试玉米品种对9种病害抗性 Tab2 Resistance ofmaize cultivars to the 9 diseases 第2期 马荣等：云南省区试玉米新品种抗性鉴定与RGA分析 211 注：品种编号1：海974；2：奥试3326；3：宁玉507；4：YA7482；5：金锋1号；6：路试042；7：DH3834；8：HK5824；9：承 241；10：兴黄单892(CK)；11：蠡玉26；12：ND128；13：黔玉3号；14：兴海201；15：BH088；16：NHD919；17：黔502；18： BH008；19：中试503；20：西山99；21：美玉063；22：TY10334：23：春喜4号；24：春喜6号；25：长城799；26：21517；27： 21517；28：金菲；29：金银818；30：先甜5号；31：先甜5号；32：库普拉；33：云超甜1号；34：路单7号；35：YA06821；36： YA74824；37：蠡试2403；38：德玉6号；39：保玉7号；40：SB2421；41：旭1446；42：TY10333。 表3 42份玉米品种对9种病害的抗性分布 Tab3 Resistance distribution of the 42 maize cultivars to the 9 diseases 212 江西农业大学学报 第31卷 图1 42个玉米新品种(系)RGA聚类 Fig1 Dendrogram of the 42 maize cultivars based On RGA amplification 22 RGA多态性分析 供试的42个品种RGA片段相关系数在084099之间，最佳相关系数是087。仅有华珍、先甜 5号、TY10334、金银818、金菲、BH088等6个品种与其余的品种相处较远。即所测试的品种RGA片段 差异不明显，以相似系数087来划分，42个品种共分为6个类群。但各群之间与实际抗病性存在一定 关系。第1类群，对弯孢霉叶斑病、丝黑穗病表现出抗性；第2类群，对灰斑病、丝黑穗病表现抗性；第3 类群对弯孢霉叶斑病、茎腐病、丝黑穗病表现抗性；第4类群，对丝黑穗病、小斑病、大斑病表现抗性；第 5类群对弯孢霉叶斑病、大斑病、小斑病表现抗性；第6类群对大斑病、小斑病表现抗性。即灰斑病抗性 品种仅集中在第2类群，茎腐病抗性品种仅集中在第3类群，抗大斑病、小斑病的品种集中分布在第4、 5、6类群，抗丝黑穗病品种集中在第1、2、3、4类群，抗弯孢霉叶斑病的品种集中分布在第1、3、5类群， 而对锈病和穗腐病抗病的品种在各群都有分布。 3 讨 论 选育抗病品种已被认为是玉米病害治理的一个重要措施，对于保证玉米高产、稳产具有十分重要意 义。本试验是在高肥栽培条件下于昆明的雨季期间进行的，各病害的症状典型，且各品种上抗感特征明 显。抗病品种病斑较小，很少产生分生孢子和表生霉层，而感病品种病斑多且大，甚至整片叶枯死。因 此，试验结果可靠。 玉米灰斑病在我国是上世纪9O年代于辽宁省和河北省发生，近几年来在山东胶东半岛、四川省及 云南省发生，特别是云南省近年来已成为玉米产量的限制因素。依据本研究结果来看，绝大部分品种对 灰斑病的抗性较差，中抗以上的品种仅占2857，它们对穗腐病、茎腐病、纹枯病抗性亦较差。因此， 在今后的育种工作中要特别注重抗灰斑病、穗腐病和茎腐病基因的利用，选育抗病自交系。与上述几种 病害相比，玉米对大、小斑病的抗性要好得多，这可能与这两种病害曾经在历史上造成过重大损失，育种 者特别关注抗病育种有关。 张成华等 刨研究表明我国抗病育种目标单一，常以高抗某一病害为目标，缺乏多抗品种。同时，高 水平抗性通常由单基因控制，这种基因转入育成品种后，往往在短短几年后由于其对病原的定向选择而 使自身抗病性迅速降低甚至丧失。本实验的结果表明，海974能兼抗7种病害，德玉6号、蠡试2403、 第2期 马荣等：云南省区试玉米新品种抗性鉴定与RGA分析 213 TY10333等20份品种能兼抗5种以上病害，如果农艺性状较好，它们将会在云南等地发挥积极作用。 抗病鉴定是选育抗病品种的关键，传统的鉴定方法选择效率较低、周期较长，已不能满足当前玉米 生产对优良品种的需求。多数人认为用抗病基因类似序列来定位、克隆抗病基因是一种简捷、有效的途 径n。本实验通过研究表明大田人工接种结果与室内分子水平的鉴定结果基本一致。特别是利用抗 病基因类似序列片段信息，能很好地将42个品种分成不同的6大类，且各大类与抗性有很好的关联，这 表明本研究的结果对缩短育种周期，加速抗病品种选育进程有重要意义。 参考文献： 1李建生玉米分子育种研究进展J中国农业科技导报，2007，9(2)：1013 2李培富，翟虎渠，张红生，等两个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病的遗传研究J中国水稻科学，1999，13(1)：11 14 3方中达植病研究方法M3版北京：中国农业出版社，1998 4刘爱国，张成和，石洁玉米杂交种对多种病害抗性鉴定结果初报J华北农学报，2000，15(增刊)：8589 5龚国淑，叶华智，王华，等玉米种质资源对弯孢菌叶斑病的抗性评价J西南农业大学学报，2005，27(6)：855 860 6徐秀德，董怀玉，姜钰，等玉米灰斑病抗性鉴定技术J植物保护学报，2003，30(2)：129132 7PRC Department of AgricultureThe technical specifications on COrn pests and diseases identification(1)PRC ag(iculture in dustry standardS2002 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