大孔吸附树脂在瑞拉菌素高产菌GAo-1-GR-2活性物质提取中的应用

第49卷第5期 20l0年5月 农药 AGR0CHEMICALS Vl0149NO5 Mav 2010 大孔吸附树脂在瑞拉菌素高产菌GAo一1一GR一2 活性物质提取中的应用 程建坤，侯冬媛，苟丽霞，安德荣 (G-It农林科技大学植物保护学院陕西，肯农业分子生物 蕾点熨舱室，陕西杨凌712lOO) 摘要：以瑞拉菌素高产菌GAO一1一GR一2发酵液为基础，选刷不同粗捉温度和5种不问的大孔吸附树脂提取瑞拉 菌素高产菌GAO一1一GR一2抑菌活性物质，以稻瘟菌为指示菌，进行吸附条件优化 结果表明：最佳粗提温度为 60，GAO一1一GR一2抑菌活性物质活性最强且提取效率最高，HP一20对活性物质的吸附效果较好，并且获得了 较优的吸附条件：上样液pH值为60，最佳的吸附流速为20 mLmin，最佳的洗脱液为体积分数50甲醇、70乙 醇和30丙酮，洗脱液最佳流速为15 mLmin 关键词：瑞拉菌素；大孔树脂；吸附；优化 中图分类号：TQ450 文献标志码：A 文章编号：10060413(2010)05033404 Macroporous Resin in Adsorption Process of an Tifungal Produced by Zuelacmycinhighyielding Strain GAO一1一GR一2 CHENG Jiankun，HOU Dong-yuan，GOU Li-xia，AN De-rong (Colleg of Plant Protection and Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture， Northwest A&F University,Yangling 7 1 2 1 00，ShaanxiChina) Ataet：Based on fermentation broth of Zuelacmycinhigh-yielding strain GAO一1-GR一2，antifungal active substances were extracted from the fermentation broth OD the conditions of different extracting temperatures and five different kinds of macroporous adsorption resinsPhyricularia grisea was used as indicating microorganismThe results showed that the optimum extracting temperature was 60。C and macroporous adsorption resin HP一20 had better adsorption effect to active substancesAfter the optimization of absorption conditions，the optimum pH of sample was 60，optimum absorption velocity was 20 mLmin，the optimum component of eluent was methanol 50，ethanol 70and acetone 30(by vo1)， the optimum velocity of eluent was 15 mLmin Key words：zuelacmycin；macroporousresin；adsorption；optimization 大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类具有 多孔立体结构的非离子型人 合成的有机高分子聚合物 吸附剂，它在抗生素分离纯化、天然产物的分离、Lf1成药的 制备及质量控制、色素的分离纯化、生化药物研究、环境保 护及其他领域有广泛应用 。 。微生物代谢物的分离纯化 目的在于从发酵液中分离并纯化成高纯度的、符合药典规 定的各种微生物药物，又称为发酵液的后处理或下游过程 fdownstream processing) 。在植保lr作中，最近l 0年农用抗 生素的筛选和应用虽已成为学术界研究重点，但就其数量、 质量和品种而言还远远不能满足农业生产发展的要求 瑞拉菌GAO一卜GR一2菌株是以委内瑞拉链霉菌新变 RL-2(Streptomyces venezuelaevar Qinlingensis RL一2) 为基础，以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET】52和复 制型pHZ1358为出发质粒，通过供体大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)进行属问接合转移瑞拉菌素产生 菌获得的高发酵效价的工程菌株，口前还没有其活性物质 收稿日期：2010-0224，修返日期：2010-0320 的纯品，在其活性物质的提取_r艺上目前正处在摸索阶 段。实验证明GAOl_GR一2抑菌活性物质对稻瘟病菌、小 麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌等有强拮抗作 朋，其活性物质的开发利用将很有意义，从工业生产的角度 说，选择好的提取一 艺有利于保持活性以及提高活性物质 的收益，为将来的T业化生产和工业化合成指明了方向。 在未来的农作物病虫害防治方面将有巨大的市场需求。 因此进一步加快农用抗生素的研制、产业化和推广应用进 程必将产生巨大的社会、经济和生态效益 。 1材料与方法 11材料 111菌种 瑞拉菌GAOl_GR一2菌株：以委内瑞拉链霉菌新变种 RL一2为基础，以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSETI52 f复制 4PHZ1 3 5 8为fI发质粒，通过供体大肠杆菌 ET12567(puz8002)进行属间接合转移瑞拉菌素产生菌获 基金项目：国家“863项目”资助(2007AA021503) 作者简介：程建坤(198l一)，男，河北廊坊人，在读硕 ，研究方I；l：微生物资源利Hj E-mail：jiankun155163corn 通讯作者：安德荣(1963一)+男，教授博1。 导师：E-)nail：anderong323I 63 Corn 第5期 程建坤，等：大孔吸附树脂在瑞拉菌素高产菌GAolGR一2活性物质捉取中的应用 335 得的高发酵效价的T程菌株。 _二角瓶中，然后加含抗真菌活性物质粗品质量浓度为 供试病原菌：稻瘟病菌 cu ，彳a g打sea。 300 mgLfl，置于摇床12 140 rrain、30吸附4 h 11-2培养基 抑菌活性测定培养基为PDA培养基：马铃薯200 葡萄 糖20 琼脂粉1 8 g、碳酸钙02 g、硫酸镁0，2 g、蒸馏水定容至 1 L、自然pH值；发酵培养基：黄豆饼粉20 g、葡萄糖lO g、玉 米淀粉15 g、磷酸氢二钾05 g、碳酸钙25 g、水1000 mL。 12主要仪器 恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子分析天平、移液枪、 10ITIITI X 700mm层析柱、离心管、卡尺等。 13方法 131不同浓缩温度对活性物质的影响 GAOl_GR一2菌株的液体培养：在250 mL的三角瓶 中装入100 mL黄豆饼粉液体培养基，封口，灭菌。待冷却 后用接种针挑取少量GAO卜GR一2菌落于液体培养基中， 置于恒温摇床上，在140 rmin、30 oC的条件下培养72 h。 发酵液预处理：发酵液用l molL酸NpH值，边加边搅 拌，调pH值到30静置23 h，4 200 rrain离 t,30 rain，取上 清液过滤，收集滤液待用。 发酵液在旋转蒸发仪中分别采用40、50、60、70、8O、 90、100 qC同温度下减压浓缩，浓缩至原体积的110，用 6 molL氢氧化钠调pH值到70，5 000 rmin离 1230 rain，弃 沉淀，取上清液，加入1 体积的无水乙醇，静置30 min，弃上 清液，40烘干沉淀获得褐色粉末，不同浓缩温度得到的 活性物质粗品进行抑菌活性测定，以确定最佳浓缩温度。 132活性物质提取过程中吸附树脂的选择 根据不同大孔吸附树脂的不同吸附性质，选择了5种 大孔吸附树脂，分别为HP一20、HP一21、D204、XAD一18、 XAD一16在5个250 mL三角瓶中分别加入l0 g处理好的 HP一20、HP一21、D204、XAD一18、xAD一16等5种不同型 号的湿树脂，分别注人300 mgL的活性物质粗提稀释液 200 mL，置于摇床上，30、140 rrain吸附24 h，分别在 05、l、2、4、6 h取相同体积被吸附的300 mgL性物质粗 品稀释液母液做抑菌试验，比较不同吸附树脂对活性物 质的吸附能力，以确定最佳的吸附树脂。 133不同pH值对HP一20树脂吸附的影响 分别称取10 g处理好的湿树脂6份放于6个250 mL 角瓶中，分别注入300 mgLl性物质稀释液200 mL， 分别凋pH值为2、46、8、10、12，置于摇床上，30、140 rmin， 在4、8 h时对母液进行抗真菌活性测试，以确定吸附时最 佳的pH值。 134洗脱液的筛选 分别称取5 2处理好的HP一20湿树脂于30250 mL 后，用滤纸过滤除去残余母液，过滤树脂分别用体积分 数10、20、30、40、50、60、70、80、90和 l00的甲醇、乙醇和丙酮进行解吸，对解吸液进行抗真 菌活性测试，以确定最佳的洗脱液。 135不同质量浓度稀释液对HP一20树脂吸附的影响 称取4份100 g处理好ffHP一20树脂填充于(10 mm x 700 ram)取含抗真菌活性物质粗品稀释质量浓度分别为 100、200、200、300、400 mgL122相同流速过层析柱，分别对 上样流出液和水洗液进行抗真菌活性测试，以确定最佳的 稀释质量浓度。 136吸附流速的筛选 取含抗真菌活性物质粗品质量浓度为300 mgL稀释液 200 mL，分别上柱，以10、20、30、40、50 mLmin流 速进行吸附，收集上样流出液。上样完毕后，等待1 h用 200 mL蒸馏水以10 mLmin流速洗柱，收集水洗液。对 上样流出液和水洗液进行抗真菌活性测试，以确定最佳 吸附流速。 137洗脱液流速对解吸的影响 取含抗真菌活性物质的粗品，稀释成质量浓度为 3O0 mgL，分别取300 mL上3根层析柱，以20 mLmin流 速过层析柱，取300 mL蒸馏水以10 mLmin通过层析柱除 杂质。均依次用100 mL 50甲醇、70乙醇、30丙酮分别 以15、20、25 mLmin流速洗脱，对洗脱液进行抗真菌活 性测试，以确定洗脱液的最佳流速。 2结果与分析 21不同浓缩温度得到活性物质粗品进行抑菌活性测定 由表1可以看出浓缩温度逐步上升达到6O时，活性 物质的抑菌能力没有明显变化，超过60后活性物质的 抑菌能力明显下降。40、50时对活性物质影响很小，但 为了减少浓缩时间，选择60为最佳浓缩温度，既不影响 活性物质的抑菌效果，又提高了工作效率。 表1不同浓缩温度得到的活性物质粗品进行 抑茵活性测定的结果 垒 CH I 墨 一 一 箜 鲞 抑菌活性降低率()=(对!f抑菌 ri：径一小嗣浓缩温发抑菌 圈直径1对照抑菌陶直径100 相对抑菌率()=吸附后母液的抑菌 侄(mm)，对照抑菌 圈直7-(mm)X 100 22吸附树脂的选择 吸附l h后埘液的抑菌活性降到了对照的2397，加长吸附 时问，母液的抑菌能力也没有明显减小。D204吸附时间达 到6 h时母液抑菌活性才能降低到2397。但在吸附时间 上，HP一20需要的时问要L-LD204的时间短，可以说HP一20 的吸附效葺冀远高于D204GAOl_GE一2活性物质的吸附 由表2看f：HP一20和D204的吸附效果最好，HP一2O 效率。 表2吸附树脂的选择 23不同DH值对HP一20树脂吸附的影响 HP一20在不同pH值下吸附的结果 表3。pH值对 HP一20)CGAO一卜GE一27；q-性物质稀释液吸附的影响很明 显，在pH值为6时吸附后母液的抑菌能力很小，说明GAo一 卜GE一2活性物质稀释液在过层析柱时应凋pH值为6。 表3不同DH值对HP一20树脂吸附的影响 24洗脱液筛选结果 洗脱液筛选结果见图1。 图1洗脱液筛选结果 南图1可以看m：Hj体积分数50甲醇、70乙醇 和3O丙酮做洗脱时，洗脱液的抑菌能力明显很强， 说明用体积分数50甲醇、70乙醇和30丙酮作洗脱 时能很好的洗脱GAO一1一GE一2抗真菌活性物质。用 0-40和60l00甲醇、060和80100乙醇 和0-20和40一100丙酮能很好的洗脱杂质。 25不同质量浓度稀释液对HP一20树脂吸附的影响 由表4可以看出：当稀释液的质量浓度在300 mgL以 下时j-样流 液和水洗液的抑菌能力比较低，稀释质量浓 度高于300 mgL后上样流出液和水洗液的抑菌能力比较 高，说明稀释液的质量浓度4(300 mgLPAT附都是较好 的，但考虑到效率U,J300 mgL最佳。 表4不同质量浓度稀释液对HP一20树脂吸附的影响 26吸附流速的筛选结果 由表5可以看H：当上样流速为20 mLmin时，上样流 m液和水洗液的抑菌能力是最小的，抑菌圈直径分别为 Jl】75、3750 mm，说明上样流速最佳为20 mLmin。 表5吸附流速的筛选结果 第5期 程建坤，等：大孔吸附树脂在瑞托菌素高产菌GAO一1一GR一2活性物质提取中的腹崩 337 2_7洗脱液流速对解吸的影响 洗脱流速对解吸影响结果见图2，以15、20、25 mLmin 流速洗脱时，在收集管2卜26管处，提取物稀释液对靶标菌 的生长有很好的抑制作用，但洗脱液的流速为15 mLmin 时提取物稀释液的抑菌能力更强，从而确定GAOl_GR一2 活性物质提取时，洗脱液的最佳流速为15 mLmin。 r- 圄 褪 嚣 簦 0 2 4 6 8 10 l2 I4 I6l8 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 收集管编号 图2洗脱液流速对解吸的影响 3结论与讨论 利用大孑L吸附树脂从微生物提取液巾分离精制有效 成分或有效部位已广泛的运片j ，但瑞拉菌活性成分的大 孔吸附树脂的分离和纯化尚未见报道。 实验着重以创新为目的，摸索大孔吸附树脂在瑞拉 菌素提取中的应用技术。结果表明最佳粗提温度为60， GAO一1_GR一2抑菌活性物质活性最涅且提取效率最高， HP一201性物质的吸附效果较好，并且获得了较优的吸 附条件：上样液pH值为60，最佳的吸附流速为20 mLmin， 最佳的洗脱液为体积分数50甲醇、70乙醇和30丙酮， 洗脱液最佳流速为15 mLmin。在这种条件下，能够更好 的对菌株GAO一1一GR一2活性物质进行吸附。 近年来，从放线菌的筛选到高抗菌株的选育已经层出 不穷，但随着研究的进一步深人，活性物质的分离纯化ur 作越来越成为微生物工作者的研究热点 。由此已开发的 农用抗生素如春雷霉素、放线菌酮、农抗120、井冈霉素、阿 维菌素等不仅对多种植物真菌病害有着很好的防治作用， 而且有着化学农药无法比拟的优点” 本文只测定了瑞拉 菌素高产菌GAO一1GR 2对病原菌的抑制作用，尚需进 行盆栽试验进一步验证以及植物病原微生物的抑菌机理 的鉴定。活性物质的化学结构尚需进一步研究，为将来的 _丁业合成打基础。鉴于它已逐渐取代r活性炭和Al，O 等 经典的吸附剂，又补充了离子交换树脂的不足，还l叶I现了 亲水性强、多孔性好的亲和吸附剂，朋于分离蛋白质类药 物，可达到较为满意的纯度。这为微生物制药和从重组微 生物发酵液中分离、提取、浓缩、纯化等方面提供了极重要 的手段 】。 参考文献： 【1 海彬，李小梅大孑L吸附讨脂及其在天然产物研究中的应用 广东化工2005(3)：2325 2TOLONEN M，SARIS PEJ，SlIKAAHO M Production of Nisin with Continuous Adsorption to Amberlite XAD一4 Resin Using Lactococcus lactis N8 and L1actis LAC 48J】App Microbiol Biotechnol，2004，63(6)：659665 3】 顾觉奋，魏爱琳大孔网状吸附剂在微生物制药分离纯化J二的 应用离子交换与吸附，2002，I 8(3)：281288 4 安德荣，慕小倩，刘翠蜗土壤拮抗放线菌的分离和筛选J 微生物学杂志，2002，22f51：I一3 f5 段琦悔，慕小债，安德荣s一15906菌株活性产物对植物病原菌 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