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北难业学握 2008,1 7(5):187192 Acta Agriculturae Borealioccidentalis Sinica 枯草芽孢杆菌WQX一1碱性蛋白酶的性质及其 抗烟草花叶病毒活性初步研究 王伟伟 ,郭志波。,安德荣 ,慕小倩。,张勤福 (1西北农林科技大学植保学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌 712100; 2西北农林科技大学无公害农药研究服务中心,陕西杨凌 712100;3西北农林科技大学生命科学院 陕西杨凌 712100;4西安海浪化工有限公司海浪生物研究所,陕西西安 710000) 摘 要:为发现新的天然源抗植物病毒活性物质,从枯草芽孢杆菌wQX1的发酵液中粗提了碱性蛋白酶, 并初步测定了其抗TMV活性及其酶学性质。结果表明,w Q 1碱性蛋白酶作用最适温度为50;在硼酸一 硼砂缓冲液中的作用最适pH为78;在Tris HC1缓冲液中的作用最适pH为80;在pH61O范围内,45 以下酶的性质稳定;对干酪素、明胶、牛血清白蛋白和精炼丝素均具有一定的降解能力,其中对干酪素的降解 力最强。采用半叶法测定了其抗烟草花叶病毒TMV的活性,发现该酶对TMV的体外钝化作用明显,在酶 液浓度为50 mgL时,其钝化效果即可达到534O ;而该酶对TMV的初侵染和体内复制增殖也具有一定 的抑制能力。试验结果表明,在TMV侵染前24 h施用浓度为200 mgL碱性蛋白酶液抑制其侵染力的效果 达到5035 ,而在TMV侵染后抑制其复制增殖的作用并不明显。可见,该酶是一种性质稳定的广谱性蛋白 水解酶,并具有一定的抗TMV活性。 关键词:枯草芽孢杆菌;碱性蛋白酶;抗病毒活性;性质 中图分类号:$43241 文献标识码:A 文章编号:1004 1389(2008)06 018706 The AntiTMV Activities and Properties of Alkaline Protease from Bacillus subtilis W-QX-1 WANG Weiwei ,GUO Zhi_bo ,AN Detong ,MU Xiaoqian。and ZHANG Qinfu (1College of Plant Protection and Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Yangling Shaanxi 7 1 2 1 00,China; 2Center of Biorational Pesticide Research and Development,Yangling Shaanxi 712100,China;3College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;4Xian Hilevel Chemical Industry CO,LTD,Xian Shaanxi 710000,China) Abstract:In order to find a new plant virus inhibitor from native source,the study purified an alkaline protease from the culture of Bacillus subtilis WQX一1。and primary determined its antiTMV activity and its propertiesThe test result indicate:The optimum temperature for hydrolysis of casein were 5O。C;The optimum pH were 78 in borate buffer and 80 in Tris buffer,respectively;The enzyme was stable up to 45,within the pH range of 610:The alkaline protease could hydrolyze some nat ural protease like casein、soluble silk fibroin、pure fibroin、bovine serum albumin and gelatinBy half leaf method on Nicotiana glutinosa,the inhibition rate against TMV was 5 340 when the concen tration of the alkaline protease was 50 mgI ,and the efficiency of inhibiting infectivity of TMV of 48 h applied before inoculation was 5035 when concentration of the alkaline protease was 200 mgI Therefore,the alkaline protease which had a stable character and a broad action spectrum could inacti vated TMV effectively 收稿日期:2008 05 12 修回日期:200810-25 基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(No2007AA021503)。 作者简介:王伟伟(1982一),女,黑龙江嫩江人,在读项士,专业方向:微生物资源利用。Email:www7881335163corn *通讯作者:安德荣(1963一),男,教授,博导,主要从事植物病毒学和微生物资源学研究。Email:anderong323163 com 西北农业学报 Key words:Bacillus subtilis;Alkaline protease;Antivirus activity;Property 植物病毒病是农业生产中危害非常广泛而严 重的一类植物病害,因其防治困难,给农业生产造 成极大损失。病毒侵染寄主时,病毒外壳蛋白特 异性的作用于寄主表面未知受点而使其得以侵染 成功 ,因此,许多病毒抑制剂对植物病毒初侵染 的抑制都是直接作用于病毒,钝化病毒外壳蛋白 而使其失去侵染能力。如江山等 发现E一30与 TMV的外壳蛋白(CP)作用时,使原有的外壳蛋 白寡聚体解离;与TMV颗粒直接作用时,可使病 毒颗粒断裂。目前,抗植物病毒剂的研制主要集 中于化学方面,而利用碱性蛋白酶制剂去防治植 物病毒病迄今尚未见有关报道。因此,本研究尝 试利用碱性蛋白酶水解植物病毒外壳蛋白的能力 来防治植物病毒病,以期为植物病毒病的防治提 供一条崭新而有效的途径。由微生物法获得的碱 性蛋白酶都属胞外酶,适于大规模生产,更具有培 养简便和产量丰富等特点。目前,碱性蛋白酶主 要产生菌种有芽孢杆菌属细菌3J、链霉菌(如灰 色链霉菌、费氏链霉菌等)以及酵母 等。 本试验从产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌w_Qx_ 1的发酵液中简单提取了碱性蛋白酶,并对其抗烟 草花叶病毒活性和酶学性质进行了初步研究。 1 材料与方法 11材料 111 菌株及培养基产碱性蛋白酶菌株:枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W QX 1,由西北农林 科技大学植物保护学院病毒实验室提供。 产酶发酵培养基(pH 70):干酪素300 g、 葡萄糖400 g、玉米提取液2 mL、K。HPO 10 g、MgSO 7H 2O 01 g、H2O 1 000 mI 。 112 供试毒源及寄主植物 烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus,TMV),由西北农林科技 大学植保学院植物病毒实验室提供。供试毒源 TMV保存于普通烟(Nicotiana tabacum I )上。 病毒接种液由病叶和PBS缓冲液(001 molI , pH72)按1:5O(wV)比例研磨后,用4层纱布 过滤所得,采用常规的汁液摩擦法接种。 心叶烟(Nicotiana glutinosa),由福建农林大学 病毒研究所提供。育苗时将心叶烟种子先用温汤 浸种30 mip,然后将种子直接播于育苗盆内,将其 放人光照培养箱(温度22 c,光照16 hd,湿度 60)培养,当烟草长到56片真叶时用于试验。 113 供试药剂 Folin试剂(北京鼎国生物技 术有限公司)、L一酪氨酸(科邦生物)、干酪素(北京 市海淀区微生物培养基制品厂)、t?-巯基乙醇 (wOLsEN),其余均为国产分析纯。 12方法 121 产酶发酵 发酵培养基50 mL盛于250 mI 三角瓶中,接种菌株wQX一1后,置旋转式摇 床上,37,转速180 rmin,发酵培养3O h。 122标准酶活力测定方法 参照中华人民共 和国专业标准蛋白酶活力测定法l_6 及张树政L7 的 方法。 123碱性蛋白酶的分离纯化方法 盐析及分 级盐析方法:盐析曲线的制作参照赵永芳等_8 的 方法进行。 wQX一1发酵液经离心后,上清液用4O 饱 和度硫酸铵进行沉淀,8 000 rmin离心3O min, 弃沉淀,上清液继续加入硫酸铵使其饱和度达到 60 ,11 000 rmin离心30 min,收集的沉淀即为 粗碱性蛋白酶。 透析除盐:将分段盐析获得的沉淀先溶解于少 量02 molL,pH74硼酸缓冲液中,装入透析袋 对005 molL硼酸缓冲液4下透析,透析完全 后,用PEG6000冷冻浓缩至合适浓度进行电泳。 124抗TMV活性检测方法用半叶枯斑法在 心叶烟上测定W-OX-1碱性蛋白酶对TMV的体 外钝化作用、初侵染的抑制作用和复制增殖的抑制 作用,试验在防虫温室内进行。将透析后浓缩干燥 得到的碱性蛋白酶粉末用蒸馏水稀释成不同浓度, 另以蒸馏水为对照。左半叶为对照,右半叶为处 理。每处理接种3株,每株接种5片叶子,3 d后调 查枯斑数目,计算抑制率。试验重复3次。 抑制率一(对照枯斑数一处理枯斑数)对照 枯斑数100 。 2 结果与分析 21硫酸铵分级盐析 盐析曲线的制作:菌株WQx一1发酵培养获 得的发酵液,经离心(4,4 200 rmin,10 min,两 次)去菌体,上清液为粗酶液。取等体积粗酶液, 分别加入硫酸铵粉末,使硫酸铵饱和度分别为 3O 、4O 、5O 、6O 、70 和80 ,4。C下静置 6期 王伟伟等:枯草芽孢杆菌W QX一1碱性蛋白酶的性质及其抗烟草花叶病毒活性初步研究 过夜,8 000 rrain离心30 rain,沉淀用02 tool I ,pH74硼酸缓冲液稀释到相同体积,按标准方 法测定酶活力,以最大酶活力为100Vo计,计算相 对酶活力并绘制硫酸铵盐析曲线,见图1。 0 3O 40 5O 6O 70 80 硫酸铵饱和度 Saturation ofammonium sulfate 图1 W-QX-1碱性蛋白酶盐析曲线 Fig1 Salting out curve of the W-QX-1 alkaline protease 从图1可以看出,当硫酸铵饱和度小于40 时,沉淀中蛋白酶的活性较低;当饱和度继续增加 时,沉淀中蛋白酶活力随硫酸铵饱和度增加 而增加;当达到60 时,蛋白酶活力基本上不再 增加。因此,采用分级盐析,收集饱和度40 60 之间的组分,即发酵液经离心去菌体后,上清 液加入4O饱和度的硫酸铵,4。C放置数小时,离 心去沉淀,再向上清液中加入适量硫酸铵使饱和 度达到60 ,4过夜,离心收集沉淀,即为粗酶 蛋白。 22 W-QX一1碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒活性测 定结果 221 WQX一1碱性蛋白酶对TMV体外钝化 作用的测定结果将碱性蛋白酶用蒸馏水稀释成 4个浓度(20 mgI 、50 mgI 100 mgL、200 mgI ),另以蒸馏水为对照,与病毒等体积混合 20 min,在寄主植物上以半叶法磨擦接种,测定结 果见表1。从表1可以看出,该酶对TMV具有明 显的体外钝化作用,且随酶液浓度的增大,钝化效 果逐渐增强,酶液浓度分别为20 mgI 、50 rag L、100 mgI 和200 mgL,其钝化效果分别达到 452O 、534O 96、6042 和7673 。 表1 碱性蛋白酶在心叶烟上对TMV体外钝化作用的测定结果 Table 1 The result of replication of alkaline protease to TMV 注:寄主材料为心叶烟;接种毒源为TMV,接种浓度为2 ;右半叶为处理,左半叶为对照;数据为重复三次后的平均值。下表同此。 Note:The material was Nicotiana glutinosaThe inoculation virus was TMV,and the inoculation concentration is percent twoThe right half leaf was treated by alkaline protease,and the left half leaf was checkThe test data was average of three repeats 222 碱性蛋白酶抑制TMV初侵染作用的测 定结果 枯斑分析法测定了菌株w QX一1产碱 性蛋白酶在心叶烟上对TMV初侵染的抑制作 用,测定结果见表34。可以看出,该蛋白酶对 TMV初侵染具有较好的抑制作用。施药24 h后 接种,测定碱性蛋白酶对TMV初侵染的抑制效 果。结果发现,酶液浓度在50、100和200 mgL 时,对TMV的抑制效果分别为4418 、461O 和5035 ;施药48 h后接种,该酶对TMV的抑 制作用在酶液浓度为50、100和200 mgL浓度 下,分别为4401 、4710 和4912 。表2结 果显示,在施药48 h后接种的抑制效果与施药24 h后接种的抑制效果无明显差异。 223 碱性蛋白酶抑制TMV复制增殖作用的 测定结果采用枯斑分析法测定了菌株wQX一1 产碱性蛋白酶在心叶烟上抑制TMV复制增殖作 用效果。从表3可以看出,蛋白酶抑制TMV复 制增殖作用效果不高,酶液浓度达到200 mgL 时抑制效果仅为3435 ,低于蛋白酶的钝化效 果和抑制TMV初侵染效果。 23 W-QX一1碱性蛋白酶的性质 231 最适作用温度 在02 molI PH 74硼 酸缓冲液中,分别在3O、4O、45、50、55和60C下, 按标准方法测定酶活力,以最大酶活力为100 加柏加O _州 州_u矗D _对一 装 烬避苌 西北农业学报 17卷 计,计算相对酶活力(图2)。结果发现,该酶的最 较高的酶活力。 适作用温度出现在50。C,且在45-60之间都有 表2碱性蛋白酶在心叶烟上抑制TMV初侵染作用的测定 Table 2 The determination of inhibiting infectivity of alkaline protease t0 TMV 酶液浓度(mgI ) Concentrati0n of solution 接种部位 十 Inocuiation阳rt : :“ 枯斑总数个 N0。of necrotic lOcal lesion 平均枯斑数个 Mean value 抑制效果 Inhibition result 12O 100 8O 60 40 20 O 20 30 40 50 60 70 温度V Temperature 图2碱性蛋白酶的最适作用温度 Fig2 Optimal reaction temperature of alkaline protease 232 最适作用pH 分别在02 molL硼酸 一硼砂缓冲液和TrisHC1缓冲液的不同pH下, 按标准方法测定酶活力,以最大酶活力为100 计,计算相对酶活力,结果发现该酶在不同成分的 缓冲液中最适pH值有一定的差异,在硼酸一硼砂 缓冲液中的最适作用pH为78,在TrisHC1缓 冲液中的最适作用pH为80(图3)。 6 7 pH 9 6 7 8 9 pH 图3碱性蛋白酶的最适作用pH Fig3 Optimal reaction pH of alkaline protease 如舳 鲫 =l 一 0时 对_【o R磨溢靛 =l一 州 u o _ 时一。 蟮避霞 加 如 柚 加 O _一 _Q时o 对一廿 0o 挈锚鬻 6期 王伟伟等:枯草芽孢杆菌WQX l碱性蛋白酶的性质及其抗烟草花叶病毒活性初步研究 233 热稳定性将透析后的酶液适量稀释于 02 molI pH 74硼酸缓冲液中,在不同温度下分 别保温30、60 min,取出后立即冰浴,4o。C下按标准 方法测定剩余酶活力,以最大酶活力为100计, 计算相对酶活力(图4)。结果发现,该酶同其他碱 性蛋白酶一样,耐热能力不强,45以下酶活稳定 性良好,在50下保温30 min能保留50 的酶活 力,保温60 rain后剩余酶活力为32 ,在6OoC下保 温30 min后,酶活几乎全部丧失。 l2O 20 3O 40 50 60 70 温度 Temperature 图4碱性蛋白酶的热稳足性 Fig4 Thermostability of alkaline protease 234 pH稳定性 将透析后的酶液适量稀释 于005 molL的不同pH的缓冲液(pH405 0乙酸一乙酸钠,pH6070磷酸二氢钾一氢氧化 钠,pH8090硼酸一硼砂,pill00硼砂一氢氧化 钠,pH110磷酸氢二钠一氢氧化钠,pill20氯化 钾氢氧化钠)中,于室温放置24 h,取出后立即冰 浴,再用02 molI 硼酸缓冲液调pH至74,按 标准方法测定剩余酶活力,以最大酶活力为 100 计,计算相对酶活力(图5),结果发现该酶 在pH60100的范围内稳定性良好,其中在 pill00时稳定性最好。 235 对几种天然蛋白质的降解 将透析后的 酶液适量稀释,在各反应系统中,分别加入干酪 素、明胶、牛血清白蛋白、精炼丝素及可溶性丝素 10 mg和酶液1 mI ,40。C反应20 rain,6 000 r rain离心后取上清液按照AlderNissen的方法 测定氨基含量,结果(图6)发现,该碱性蛋白酶对 对干酪素的水解能力最强,其次是可溶性丝素,对 明胶、牛血清白蛋白和精炼丝素也具有一定水解 的能力,说明该碱性蛋白酶是一种广谱性的蛋白 水解酶。 12O 3 4 5 6 7 8 9 l0 11 12 13 pH 图5 pH对酶稳定性影响 Fig5 pH stabilization of alkaline protease 明胶 干酪素 牛白蛋白 精炼丝素 可溶性丝素 Gelatin Casein Bovae xl珊Pureillyria Sotublo silk albumin fibroin 图6碱性蛋白酶对天然蛋白质的降解 Fig6 Hydrolysis of natural protein by alkaline protease 3 讨论 抗病毒活性物质抑制植物病毒的作用主要表 现在4个方面 :直接作用于病毒,如与病毒 体外结合,降低病毒粒体对寄主的识别能力,导致 病毒失去侵染力;作用于寄主上病毒侵染接受 位点;诱导植物产生抗病性;抑制病毒在寄主 体内复制。半叶法生物测定表明,枯草芽孢杆菌 wQX一1产生的碱性蛋白酶对TMV有明显的体 外钝化作用,其抑制中浓度为3395 mgL,说明 该酶在较低浓度下对TMV有很好的钝化效果。 同时,该酶对TMV的初侵染和其在寄主体内的 复制增殖也具有一定的抑制作用。 酶学性质测定结果显示,枯草芽孢杆菌w_ QX 1产生的碱性蛋白酶在456O之间都具有 较高的酶活力,且在5o下保温30 rain后剩余 酶活力能保持50 以上,与邱秀宝等口 报道的短 小芽孢杆菌碱性蛋白酶BP相比,该酶具有较好 的热稳定性;同时该酶也具有良好的酸碱稳定性, 在pH60100的范围内,剩余酶活力均保持在 7O 以上;大多数微生物碱性蛋白酶的最适pH 舳 0 0对o 一=l砖一Q 呈避莨 圈国墨 一 I 一 墨 一 国圈豳墨 一 墨 O 5 O 5 O 5 3 2 2 1 l O O O O 0 O O 0_l 对 口Qu 00 o盘一目 J 昱目 、 爨醐葺 加 加 o =| u对o 一 耐_【 蜉避捉罢 192 西北农业学报 17卷 在911之间,如邱秀宝等报道的短小芽孢杆菌 209碱性蛋白酶最适pH为91Ol1 ,相比之下 该酶最适pH较低,因此不易在存储过程中发生 变性和在使用过程中产生药害,也不易对包装材 料产生腐蚀现象,而适于农药制剂的生产。另外 该碱性蛋白酶还是一种广谱性的蛋白水解酶并且 对TMV病毒粒子有良好的钝化作用,同时由于 该酶原材料来源广、提取方法简单、易制成水溶 液,因而具有良好的开发应用前景。 但是该酶对TMV其他方面的作用机制本试 验并未作深入研究,因此,笔者认为应进一步探讨 该酶对病毒粒子结构的影响及其作用位点,同时 还要探讨该酶是否具有对植物抗病性的诱导作 用,以期更进一步掌握wQX一1碱性蛋白酶的抗 病毒机制,为将其开发为有效的植物病毒抑制剂 提供依据。 参考文献 1 2 3 4 French C J,Towers GHNInhibition of infectivity of po tato virus x by flavonoidsJPhytochemistry,l992,3】 (9):3017 3020 江 山,韩熹莱植物病毒病化学防治的研究进展J中 国病毒学,1995,1O(1):1-6 Shikha,Adhyayan Sharan,Nandan SDarmwa1Im proved production of alkaline protease from a mutant of al kalophilic Bacillus pantotheneticus using molasses as a sub strateJBioresource Technology,2007,4:881885 Ravichandra Potumarthi,Subhakar Ch,Annapurna Jet tyAlkaline protease production by submerged fermenta tion in stirred tank reactor using Bacillus licheniformis E5 6 7 8 9 1o I1 12 13 14 15 163 NCIM 2042

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