硅酸盐细菌的分离、鉴定及其生物学特性研究

江西农业大学学报 2013， 35( 3) : 609 614 http: / /xuebao jxau edu cnActa Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E mail: ndxb7775 sina com硅酸盐细菌的分离、鉴定及其生物学特性研究胡 洲1， 吴毅歆2， 毛自朝2， 何月秋1， 2*( 1 云南农业大学 农业生物多样性应用技术国家工程研究中心 ， 云南 昆明 650201; 2 云南农业大学 农学与生物技术学院 ， 云南 昆明 650201)摘要 : 采用硅酸盐细菌培养基分离法从全国采集的 288 份土样中分离出具有解钾能力的硅酸盐细菌 8 株 ， 依据菌落形态 、生理生化特性鉴定和 16S rDNA 全序列分析 ， 它们被鉴定为胶质类芽孢杆菌 ( Paenibacillus mucilaginosus) 。采用火焰亮度计测定其可溶性钾的含量 ， 其中 K1 和 K3 菌株的解钾量分别比对照组高 48 16% 和 56 57%， 达到 773 g/g 和 908 g/g。盆栽试验的结果表明 ， 25 d 后 K1 提高玉米苗的根长 、株高 、叶宽和鲜质量分别达4291%、1888%、911%和 11673%， K3 分别对应提高 7251%、2281%、1406%和 19851%。关键词 : 硅酸盐细菌 ; 分离 ; 解钾 ; 促生中图分类号 : Q9391 文献标志码 : A 文章编号 : 1000 2286( 2013) 03 0609 06Isolation， Identification and BiologicalCharacterization of Silicate BacteriaHU Zhou1， WU Yi-xin2， MAO Zi-chao2， HE Yue-qiu1， 2*( 1 National Engineering Center for Applied Technology of Agriculture Biodiversity， Kunming 650201;2 Faculty of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China)Abstract: Eight potassium releasing strains were isolated from 288 soil samples collected from China byusing the selective medium for silicate bacteria and identified into Bacillus mucilaginosus based on their mor-phological， physiological and biochemical properties and l6S rDNA sequences Based on the analysis of solublepotassium by flame photometer among the 8 strains， the strains K1 and K3 could increase the potassium contentin the liquid medium by 4810% and 5657% compared with control In pot experiment， after 25 days K1could increase the root length， plant height， leaf width and fresh weight of corn seedling by 4291%， 1888%，911% and 11673%， and K3 could increase the correspondents by 7251%， 2281%， 1406% and 19851%compared with the controlKey words: silicate bacteria; Isolation; potassium release; plant-growth promotion目前 ， 在世界范围内限制农业产量的主要因素之一就是土壤贫瘠 ， 肥力下降 ， 补充作物生长发育所必须的营养元素已成为获得稳产 、高产不可或缺的重要措施 1。钾是植物营养所必须的大量元素之一 ， 植物在缺钾的情况下 ， 产量低下 、抗逆性差 ， 且极易发生倒伏 。钾长石和云母等硅酸盐矿物 ， 是组成地球表面岩石和土壤的主要成分 ( 占 60% 以上 ) ， 地壳中钾含收稿日期 : 2013 01 22 修回日期 : 2013 03 14基金项目 : 科技部国际合作项目 ( 2009DFA32360) 和国家高技术研究发展计划 ( 863 计划 ) 项目 ( 2011AA10A205)作者简介 : 胡洲 ( 1986) ， 女 ， 硕士生 ， 主要从事植物病理生物防治研究 ， E mail: 964602824 qq com; * 通讯作者 :何月秋 ， 教授 ， E mail: ynfh2007163 com。江西农业大学学报 第35 卷量占 235%， 在所有元素中占第 7 位 ， 其中土壤含钾量占 1 16%， 而土壤中 95% 的钾存在于钾长石 、云母这两大矿物中 。土壤钾主要以矿物 、固定钾 、代换钾和水溶钾 4 种形态存在 ， 其中只有 2% 的代换钾和水溶性钾可被植物吸收利用 2。胶质类芽孢杆菌 ( 以前称为硅酸盐细菌 ) 是土壤中一类特殊的革兰氏阴性芽孢杆菌 ， 能分解硅酸盐和铝硅酸盐组成的岩石矿物 ， 具有溶磷 、解钾及固氮能力 3 6， 尤其能将土壤中的无效钾转变为速效钾 ，供植物吸收利用 。吴洪生等 7研究发现 ， 在缺钾土壤中施用适当硅酸盐细菌制剂 ， 可使土壤中速效钾增加 1286%， 使土壤 、磷矿粉和沙子等 3 种基质平均速效钾含量比对照增加 160 6%。刘五星等 8 9研究发现胶质芽孢杆菌分解土壤矿物 ， 使可溶性钾增加了 11 97% 13 4%， SiO2含量增加 8 99% 2689%， 认为矿物溶解能力与发酵液的粘度及其中有机酸有关 。盛下放等 10 11研究发现硅酸盐细菌发酵液中可溶性钾含量达到 40 100 mg/L， 而对照只有 20 mg/L。由此可见 ， 不同的硅酸盐细菌其解钾能力存在一定的差异 ， 寻求和利用新的高效解钾菌是提高土壤有效钾含量和作物产量的重要对策 。1 材料与方法11 土样从全国不同作物根际附近 、深 5 20 cm 处取得土样 ， 用无菌袋密封带回实验室分离硅酸盐细菌 。12 培养基硅酸盐细菌培养基 : 蔗糖 50 g， Na2HPO42 0 g， MgSO47H2O 0 5 g， CaCO30 1 g， FeCl36H2O50 mg， 琼脂 180 200， pH 75 85， 蒸馏水 1 L。无氮培养基 ( 阿须贝 ( Ashby) 培养基 ) : 甘露醇 10 0 g， KH2PO40 2 g， MgSO47H2O 0 2 g， NaCl02 g， CaCO350 g， CaSO42H2O 01 g， 琼脂 180 g， 蒸馏水 1 L， pH 70。种子培养液 : 可溶性淀粉 5 0 g， 酵母膏 1 0 g， K2HPO42 0 g， MgSO47H2O 0 5， CaCO30 1 g，FeCl36 H2O 5 mg， pH 75 85， 蒸馏水 10 L。发酵培养液 : 蔗糖 100 g， MgSO47H2O 05 g，( NH4)2SO402 g， NaCl 0 1 g， CaCO30 1 g， 钾长石粉 50 g， pH 72， 蒸馏水 1 L。牛肉膏蛋白胨培养基 : 牛肉膏 50 g， 蛋白胨 100 g， NaCl 50 g， pH 74 76， 蒸馏水 1 L。13 试剂细菌的生理生化鉴定试剂参照文献 12 。14 硅酸盐细菌的分离在无菌条件下 ， 称取 10 g 土样溶于 90 mL 的无菌水充分振荡并梯度稀释成 102、103、104倍的土壤悬液 ， 然后每个稀释度各取 100 L 均匀涂布于硅酸盐细菌培养基平板上 ， 37 倒置培养 3 d。挑选无色 、透明 、半玻璃状并富有弹性的菌落 ， 进一步纯化直至获得纯培养为止 。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为 25%的甘油中并密封保存于 80 冰箱 。15 细菌鉴定151 菌落形态鉴定 用灭菌的牙签从活化后的菌株斜面上轻轻刮取少量菌体细胞 ， 加到 10 mL 的无菌水中混匀 ， 梯度稀释成 102、103和 104倍菌悬液 。分别取 103和 104倍的菌悬液 01 mL 涂布于硅酸盐细菌培养基平板上 ， 然后倒置于隔水式 303A 5S 电热恒温培养箱中培养 3 5 d， 待菌落长出后观察形态 。152 菌体特征观察 挑取在硅酸盐细菌培养基平板上活化后的各株菌落进行革兰氏染色 、芽孢染色 、荚膜染色 ， 在 M60 2 0058 e 蔡司正置显微镜下观察其菌体形态 ， 具体染色方法参照文献 13 。153 菌体的生理生化鉴定 以硅酸盐细菌培养基为基础培养基 ， 参照常用细菌系统鉴定手册 13对解钾能力较强的 K1 和 K3 进行生理生化试验 ， 包括过氧化氢酶试验 、柠檬酸盐利用试验 、葡萄糖氧化发酵试验 、甲基红试验 、V P 测定 、淀粉水解试验 、吲哚试验 、明胶液化试验和耐盐性等 ， 参照菌株为 P mucilaginosus VKPM B 7519， 由本实验室提供 。154 菌株的 16S rDNA 序列测定及系统发育树构建 细菌 DNA 提取参照 Kim 和 Rainey 14 15报道的方法 。利用 Iversen 等 16报道的细菌通用引物 P0( 5 GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3) 和 P6( 5 016第 3 期 胡 洲等 : 硅酸盐细菌的分离 、鉴定及其生物学特性研究CTACGGCTACCTTGTTACGA 3) 扩增 16S rDNA， PCR 反应也按其介绍的程序 。为进一步明确硅酸盐细菌的所属种类 ， 细菌 DNA 的提取参照 Kim 和 Rainey 16 17报道的方法 。利用 Iversen 等 16所报道的细菌 16S rDNA 通用引物 P0( 5 GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3) 和 P6( 5 CTACGGCTACCTTGTTACGA 3) 进行扩增 。扩增产物经纯化 、克隆后 ， 由华大基因公司完成测序 。序列比对用软件 BioEdit701 中的 CLUSTAL W 多序列比对程序进行 ， 系统发育树由 MEGA 50 软件构建 ， 方法为最大相似性 ( maximum likelihood) ， 模型为 Tamura Nei model 17， bootstrap 分析重复 1 000 次 。16 解钾能力的测定挑选在无氮培养基上生长良好的菌株分别接种于 50 mL 种子培养液中于 37 180 r/min 下扩大培养2 d， 作为种子液 。用移液枪取 50 mL 种子液按 4%的接种量加入 50 mL 发酵培养液中 ， 以不接任何菌液的发酵培养基为空白对照组 ， 每个处理设 3 个重复 ， 于 28 150 r/min 下培养 6 d。培养结束后 ， 将发酵液用30%的 H2O2消煮至荚膜消失 ， 在 6 000 r/min 离心 10 min， 将上清液定容至 50 mL 容量瓶中 ， 在 M410 火焰亮度计上用空白溶液调节仪器零点 ， 以标准溶液系列中的最高浓度的标准溶液调节仪器满刻度至 40 分度处测量其他标准溶液 ， 记录仪器示值 。具体操作参照土壤理化分析实验指导书 18。17 盆栽试验将采集来的土样自然风干 ， 过 8 目筛 ， 装入试验用塑料钵 ， 每钵装土 500 g。玉米种子用 30% H2O2的消毒 ， 于 37 恒温培养基箱中浸种 24 h， 催芽后播种于温室内 。选取解钾能力较强菌株 K1、K3、K4、K5、K6 发酵液 ( 浓度为 3 105cfu/mL) 和无菌水各 100 mL 分别施入各自塑料盆土壤中 ， 每个处理 3 次重复 ， 以原土样作为空白对照 。每盆播 6 粒 “会单 4 号 ”玉米种子 ， 一周后间苗 ， 每盆留 4 株 。每天定量浇水管理 。其他管理条件一致 。25 d 后调查玉米根长 、株高 、叶宽和鲜质量 ， 采用 SPSS170 进行单因素方差分析和多重比较 。2 结果与分析21 分离结果在硅酸盐细菌培养基平板上 ， 挑取圆形 、透明 、粘稠并有一定弹性的菌落 ， 经过多次划线纯化分离 ，共获得了 8 株 ( K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8) 疑似胶质类芽孢杆菌 。22 菌株鉴定结果221 形态特征 分离得到的 8 株菌落均呈无色 、透明 ， 半玻璃状 ， 边缘整齐 ， 表面光滑 ， 富有弹性且易拉成丝 。菌体革兰氏染色呈阴性 ， 杆状或短杆状 ， 荚膜肥厚 。该菌在 37 培养下 ， 1 2 d 菌落直径约 2 mm， 3 5 d 菌落直径约 5 mm。但其在牛肉膏蛋白胨培养基上生长不良 。这些特征与对照菌株及胶质类芽孢杆菌特征相似 19。图 1 K1 的菌落形态Fig1 Colony morphology of P mucilaginosus k1图 2 K3 的菌落形态Fig2 Colony morphology of P mucilaginosus k3222 生理生化试验 在所有 8 个菌株在生理生化试验中 ， 反应结果与胶质类芽孢杆菌基本一致 ， 表1 只列出了解钾能力较强的 K1 和 K3 菌株和参照菌株 P mucilaginosus VKPM B 7519 的反应型 。116江西农业大学学报 第35 卷表 1 硅酸盐细菌的生理生化特征Tab1 Physiological and biochemical tests of silicate bacteria试验Test胶质芽孢杆菌P mucilaginosus菌株 K1Strain K1菌株 K3Strain K3过氧化氢酶活性 Catalase activity + + +柠檬酸盐利用试验 Citrate utilization test 葡萄糖发酵试验 Glucose ferment experiment 甲基红试验 M R test + + +V P 试验 V P test 淀粉水解试验 Amylolysis + + +吲哚试验 Indole test + 明胶液化试验 Gelatin liquefation test + +耐盐性 ( 1%) Salt tolerance ( 1%) “ + “表示反应为阳性 ， “ “表示反应为阴性 。“ + “present positive reaction， “ “present negative reaction223 菌株的 16S rDNA 序列检测及系统发育树构建 利用引物 P0 和 P6 扩增菌株 K1 和 K3 的 16SrDNA 基因 ， 目的片段大小与预期一致 ， 经测序 ， 片段长度均为 1 410 bp。K1 和 K3 菌株的 16S rDNA 基因已提交到 GenBank， 序列号分别为 : KC762937 和 KC762938。将序列分别与 GenBank 序列相比对 ， 结果表明 ， K1 和 K3 菌株与类芽孢杆菌属 ( Paenibacillus) 的菌株序列同源性最高 。从 MEGA 50 构建的系统发育树 ( 图 3) 来看 ， 菌株 K1 和 K3 与所有的 P mucilaginosus 菌株聚为一支 。依据 16S rDNA 基因序列再次将 K1 和 K3 归入 P mucilaginosus。因此 ， 根据形态特征 、生化反应特点及 16S rDNA 基因序列 ，K1 和 K3 菌株归属于胶质类芽孢杆菌 ( Paenibacillus mucilaginosus) 。图 3 菌株 K1 和 K3 的系统发育学地位Fig3 The phylogenetic dendrogram of strains K1 and K3224 菌株的解钾能力 摇瓶培养后 ， 8 个菌株解钾能力的测定结果 ( 表 2) 表明 ， 它们的解钾能力存在较大差异 ， 其中 K3 的解钾能力最强 ， 培养液中可溶性钾的含量达 2513 g/mL， 较对照组增加了 5657%;其次为 K1， 可溶性钾的含量达 2378 g/mL， 较对照组增加了 4816%; 其余几株的解钾能力都比较低 。因各菌在培养基中的生长量相当 ， 都在 10 万 CFU/mL 数量级上 ， 所以 ， 可溶性钾含量的提高未能反映菌216第 3 期 胡 洲等 : 硅酸盐细菌的分离 、鉴定及其生物学特性研究量的增加 ， 而是反映了解钾能力存在很大差异 。表 2 硅酸盐细菌解钾能力的比较Tab2 The comparison of the ability of the silicate bacteria to release K菌株Strain可溶性钾 /( gmL1)Soluble K+解钾量 /( gmL1)Increased of soluble K+增加量 /%Increase percent含菌量 /( cfumL1)Bacterial numberK1 2378 073a 773 4816 300 103K2 1616 095c 011 069 250 103K3 2513 041a 908 5657 300 103K4 1656 075b 010 062 250 103K5 1663 062b 058 361 270 103K6 1750 061a 145 903 280 103K7 1631 039c 026 162 250 103K8 1621 051c 016 100 260 103CK 1605 031c 平均值 标准差 。同列数字后不同字母表示差异达 5%差异水平 。Average SE Different letters in the same column following the numbers mean significant difference at 5% level23 促生长作用在盆栽试验中 ， 出苗期玉米的根长 、株高 、叶宽和鲜质量等性状测定的结果见表 3。与对照相比 ， K3 处理对玉米促生长作用极显著 ， 根长 、株高 、叶宽和鲜质量的净增率分别达到了 7251%、2281%、1406%和19851%。在根长和株高方面 ， 菌株 K1、K3、K5、K6 处理显著地高于对照 ， 但菌株 K4 与对照没有显著差异 ; 在鲜质量方面 ， 各菌株处理亦显著地高于对照 ， 但 K5、K6 处理间没有显著差异 ; 然而 ， 各菌株处理的玉米叶片宽度与对照间无显著差异 。表 3 硅酸盐细菌对玉米苗期的促生长效果Tab3 Growth promoting effect of the silicate bacteria on corn seedlings处理Treatment根长 /cmRoot length增加 /%Increase株高 /cmPlant height增加 /%Increase叶宽 /cmLeaf width增加 /%Increase鲜质量 /gFresh weight增加 /%IncreaseCK 1524 014c 3442 087c 384 013a 269 020d K1 2178 096ab 4291 4092 054ab 1888 419 004a 911 583 015b 11673K3 2629 042a 7251 4227 107a 2281 438 005a 1406 803 071a 19851K4 1622 054c 643 3615 072c 503 403 003a 494 498 042bc 8513K5 2027 032b 3301 3672 045b 668 424 005a 1041 422 013c 5688K6 2210 147ab 4501 3757 064ab 915 423 007a 1015 432 010c 6059平均值 标准差 。同列数字后不同字母表示差异达 5%差异水平 。Average SE Different letters in the same column following the numbers mean significant difference at 5% level3 结论与讨论( 1) 本次试验在不同土壤中分离得到 8 株类似于硅酸盐细菌的芽孢杆菌 。通过菌落形态 、表型和生理生化鉴定 ， 以及对钾长石解钾能力的测定 ， 结合 16S rDNA 序列分析 ， 将 K1 和 K3 初步鉴定为胶质类芽孢杆菌 ( Paenibacillus mucilaginosus) 。这些菌株在硅酸盐细菌培养基和无氮培养基上的菌落形态与何琳燕等 20的描述一致 ， 表现出特有的生理生化性质 ， 贺积强等 21也对 40 株来自紫色土的硅酸盐细菌进行了包括形态 、生理生化特征等 52 个表型性状的测试 ， 均认为硅酸盐细菌具有生物多样性 。这将为未来硅酸盐细菌作为生物钾肥提供基础材料 。( 2) 本试验中供试的胶质类芽孢杆菌具有一定的解钾能力 ， 不同菌株的解钾能力存在差异 。菌株K3 的解钾能力最强 ， 培养液中可溶性钾的含量为 : 25 13 g/g， 较对照组增加了 56 57%; 其次菌株 K1316江西农业大学学报 第35 卷可溶性钾的含量为 : 2378 g/g， 较对照组增加了 4816%。据相关资料显示 ， 在缺磷源和钾源的培养基中胶质芽孢杆菌不能生长或者只能少量生长 ， 而以不溶性磷灰石作为唯一磷源或以含钾矿物作为唯一钾源时 ， 菌数分别比无磷对照增加 5 000 12 600 倍 ， 比无钾对照增加 36 165 倍 ， 同时进行定量分析发现磷释出率为 012% 0 18%， 比空白对照水溶磷增加 233% 250%， 而水溶钾增加 65% 87%( 重量法 ) 22 23。由此可见 ， 胶质类芽孢杆菌的确具有一定的解钾能力 ， 筛选出具有较强解钾能力的菌株将有利于微生物钾肥的研究 。( 3) 早在 20 世纪 50 年代 ， 胶质类芽孢杆菌 ( 过去称为硅酸盐细菌 ) 菌剂 ( 生物钾肥 ) 对作物的增产效果在前苏联已有广泛研究 24。本次试验通过对玉米盆栽实验发现 ， 与对照组相比 ， K3 处理组对苗期玉米的影响最大 ， 根长 、株高 、叶宽和鲜质量的净增率分别达到了 7251%、2281%、1406% 和19851%， 表现出显著的差异性 。在其他工作者的研究结果中也发现硅酸盐细菌在玉米 、苹果 、辣椒上具有明显的促生效果 。也有相关报道发现胶质类芽孢杆菌对各种喜钾作物如甘薯 、烟草 、棉花 、水稻等有明显的增产作用 25 26。由此可见 ， 胶质类芽孢杆菌的确具有增产 、促生长效果 ， 但菌株 K1 和 K3 究竟适用于哪些作物 ， 或对作物是否存在选择性 ? 还有待下一步验证 。参考文献 : 1 Elsheikh M A， Eltilib A M， Elsheikh A E A Note on the effect of phosphate rock， triple superphosphate， Bradyrhizobium andtheir combinations on the available soil phosphorus in Shambat clay 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