一种农杆菌介导稻瘟病菌的遗传转化

第35卷 2008 第5期 10 月 植物保护 学报 ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA V0135 No5 0ct 2008 一种农杆菌介导稻瘟病菌的遗传转化 吴毅歆 范成明 周惠萍 久保康之 何月秋h (1云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明650201； 2云南省农业科学院经济作物研究所，昆明650205；3Et本京都 府立大学农学部植物病理实验室，京都606-8522，日本) 摘要：以农杆菌C58C1及携带潮霉素抗性的质粒pBIG2RHPH2为介导，以广泛不致病的野生型稻 瘟病菌CY2为出发菌株，开展稻瘟病菌TDNA插入转化条件的研究。农杆菌OD6oo为01条件下， 乙酰丁香酮(As)200 txmolL，用IM培养基(pH 52)共培养。结果表明，在潮霉素、头孢噻肟钠和 壮观霉素为200 gmL，2mm滤纸条筛选培养，转化效率最高，平均可获得3290个转化子110 个孢子。通过对转化子的继代稳定性和PCR检测，证明转化子均获得了TDNA插入片段，且能稳 定遗传。采用接种法，在不同遗传背景的44个抗稻瘟病的水稻近等基因系接种8000个转化子，获 得20个致病突变体。 关键词：稻瘟病菌；农杆菌介导遗传转化；TDNA插入突变 A genetic of transformation of Magnaporthe grisea by Agrobacterium tumefaciens Wu Yixin Fan Chengming Zhou Huiping Yasuyuki Kubo He Yueqiu (1Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control，Ministry of Education，Yunnan Agrlcultural University，Kunming 650201，Yunnan Province，China；2Cash Crop Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，Yunnan Province， China；3Laboratory of Plant Pathology，Faculty of Agaculture，Kyoto Prefectural University，Kyoto 6068522，Japan) Abstract：TDNA insertional transformation system of a universal non-pathogenic Magnaporthe grisea iso late CY2，was improved with Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 carrying plasmid pBIG2RHPH2 harboring the hygromycin B geneThe result showed that total 329 transformants could be obtained per 1 10 spores when C58C1 was 01 at OD6oo，induction medium with pH 52 containing acetosyringone at 200 IxmolL，selection medium containing 200 IxgmL of hygromycin B，cefotaxime sodium and spectino mycin each and 2 mm wide filter paper stripe were usedThe transformants were stable when they grew on CM medium without hygromycin B for 5 times and were verified with PCR amplification based on the primer pairs of the hygromycin resistance geneBy artificial inoculation on 44 near-isogenic lines with dif- ferent backgrounds，20 pathogenic mutants were isolated out of 8 000 transformants Key words：Magnaporthe grisea；Agrobacteriummediated transformation；T-DNA insertional mutagenesis 基金项目：农业部“948”项目(2006-G61)，国家科技部“863”计划(2002AA245041) 作者简介：吴毅歆，女，1968年生，副研究员，研究方向为分子植物病理，email：wyx680705sinatom 通讯作者(Author for correspondence)，email：heyueqiutomtom 收稿日期：20080528 422 植物保护学报 35卷 基因插入失活获得能够覆盖全基因组的突变体 库是功能基因组学研究的基础性工作。在真菌中最 常用的插入失活方法是根癌农杆菌介导转化系统 (Agrobacterium tumefaciensmediated transformation， ATMT)，长期以来一直被用于各种植物的遗传转 化，其插入突变工具T-DNA(transferred DNA)也广 泛应用于拟南芥等植物的功能基因研究 J。随着 de Groot等口 将这一转化系统成功用于丝状真菌的 遗传转化，ATMT成为了基因克隆及功能分析的一 种重要手段，通过该方法实现转化的丝状真菌已达 60余种 J。目前，能够用于转化丝状真菌的农杆菌 很多，如AGL1、EHA105、LBA1100、LBA4404等都 曾被用于丝状真菌的转化 J，其中仅AGLl用于介 导稻瘟病菌的转化 J。 稻瘟病菌遗传转化子系的建立是在分子水平上 研究病原菌致病机制的前提，同时有效的转化系统 可以用来导入有益的外源基因，获得带有目的性状 的工程菌，而后者可能直接用于生产实践，为病害防 治提供了一种新的办法。遗传转化的效率极大地影 响着真菌功能基因组学研究的开展和深入。作者在 前人研究的基础上，以一种农杆菌C58C1及携带潮 霉素抗性的质粒pBIG2RHPH2为介导，以广泛不致 病的野生型稻瘟病菌CY2为出发菌株，优化ATMT 方法的条件，建立稻瘟病菌插入转化子库。通过部 分转化子的致病性筛选，构建无毒力CY2的致病突 变体库。 1材料与方法 11材料 111农杆菌与质粒：转化受体为广泛不致病的野 生型稻瘟病菌株CY2(李成云教授惠赠)的1个单 孢菌系。转化供体为携带质粒pBIG2RHPH2(图1) 的根癌农杆菌C58C1，质粒属于双元载体，带有 P 皿基因(新植霉素磷酸转移酶基因)和脚 基因(潮霉素B磷酸转移酶基因)，由日本京都府立 大学Kubo教授惠赠。 Xb 图1质粒pBIG2RHPH2图谱 Fig1 Map of plasmid pBIG2RHPH2 112供试品种：水稻品种为丽江新团黑谷及其近 等基因系材料 、CO39及其近等基因系品种 加 和 国际水稻所(IRRI)以普感粳稻品种丽江新团黑谷 为轮回亲本培育的稻瘟病抗性单基因系 ，共44 个品系(表1)。 表1供试水稻品种 Table 1 Rice cuhivars used 品种 抗病基因 品种 抗病基因 品种 抗病基因 品种 抗病基因 Cuhivar Rgene Cuhivar Rgene Cultivar Rgene Cultivar Rgene I H C1O4PKT Pi一3 IRBL3 Pii IRBL一14 Pib F801 Pi一 A57 Pi一，2 IRBL-4 Pik IRBL一15 ，J t F987 Pi一 BL121 P一J，2 IRBL_5 Pi一 IRBL一16 Pi sh F1241 P一ta BL122 Pi一1，2 IRBL_6 P k IRBL一17 P s F1281 P 口 BL123 PiJ，2，3 IRBL7 Pi一 IRBL一18 P J F1291 Pi一 BL13 P一J，3 IRBL一8 Pik IRBL19 Pi3 F1452 Pib BL141 Pi一1，4 IRBL9 P一 IRBL0 P (t) C039 PiC039 BL241 Pi-2，4 IRBL一10 Pi IRBL一21 一7(t) C101 A51 Pi-2 BI23 Pt一23 IRBL一1 1 P 嵋 IRBL一22 Pi一9(t) C1O1 IIAC P 一1 IRBL一1 P一口(J) IRBL12 尸 一托! IRBL3 P-12(t) C101 PKT P -4a IRBL2 Pia(2) IRBL一1 3 Pita IRBL一24 Pi一19(t) 5期 吴毅歆等：一种农杆菌介导稻瘟病菌的遗传转化 113培养基：诱导培养基(IM)、普通培养基 (LB)、共培养培养基(CM)和番茄燕麦培养基参见 文献1214。 114试剂：潮霉素(hygromycin)B，购自Roche公 司；卡那霉素(kanamycin)、头孢噻肟钠(cefotexime sodium)和壮观霉素(spectinomycin)，购自Sigma公 司；十二醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠(MES)和 各种氨基酸，购自Amresco公司；乙酰丁香酮(AS)， 购自FLuka公司；ECL核酸直接标记和检测试剂盒 (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems)，购自Amersham Biosciences UK公司；Hy bond N+membrane，购自Amersham Pharmacia Bio tech公司；其它试剂均为国产分析纯。 12转化体系建立 121农杆菌培养：取保存在一80的农杆菌 C58C1划线培养于含100 mL卡那霉素的LB培 养基，28暗培养23天，待菌落长出后挑取单菌 落接种于50 mL添加上述卡那霉素的IJB液体培养 基中，于28、220 rmin振荡培养至对数生长期。 按1：100比例重悬菌体于IM+AS液体中，28 220 rmin振荡培养46 h，调节农杆菌0D值至 01，作转化供体备用。 122稻瘟病分生孢子培养：野生型稻瘟病菌CY2 的孢子培养同常规。孢子培养后，取5 mL IM+AS 液体培养基，用灭菌棉签轻刷菌体表面洗下孢子，用 两层灭菌擦镜纸过滤收集孢子液，用血球计数板计 孢子液原始浓度 ，配制成不同浓度的孢子液作为 转化受体。 123转化：分别取孢子液和农杆菌液各500 IXL于 15mL离心管中混匀，先将直径70mm滤纸贴在IM 固体培养基上，取300 IXL混合液均匀涂抹于滤纸片 上，28下黑暗培养不同时间，再将共培养后的滤 纸放在筛选培养基CM(含有潮霉素、头孢噻肟钠和 壮观霉素各200 gmL)上，于28培养47天。 待长出转化子，挑取转化子到番茄燕麦培养基上培 养，接种备用。 13影响农杆菌转化效果的因素 分别进行共培养的筛选方法、时间、AS添加方 式和分生孢子浓度等因素对农杆菌转化效果的影响 试验。处理中，分别定某一因子为变量，以对应因子 为对照，观察各影响因子对转化效率的影响。每处 理重复3次，取平均值。 14转化子的分子检测 为测定潮霉素抗性基因在转化子基因组中的遗 传稳定性，随机选取9个稻瘟病菌转化子接种到不 含潮霉素的CM培养基上连续培养5代，然后接种 到含潮霉素的培养基上，26下培养。 转化子在含100 IxgmL潮霉素的CM液体培养 基中25振荡培养4天，用灭菌的滤纸过滤，用无 菌水洗两次，于4O烘干，保存在一4备用。转化 子基因组DNA的提取采用CTAB法_1 。用引物 HPH1(ACGrIT从CTCATArITIG从GGAGCAT)和HPH2 (ACGrITrAACT(棚CcGGTC)扩增pBIG2RHPH2质 粒中的14 kb潮霉素基因。PCR程序为：94变性 2 min，94 oC 30 S、601 min和7215 min，共35 个循环，最后72延伸10 min。 为测定所获得的稻瘟病菌TDNA转化子的拷 贝数，随机挑取9个转化子，用EcoRI消化后，进行 电泳、转膜，用EcoRI和XbaI切下pBIG2RHPH2质 粒上14 kb潮霉素抗性基因，以潮霉素抗性基因为 探针进行Southern杂交分析。Southern杂交和探针 标记按ECL试剂盒上提供的方法进行。 15转化子致病性测定 随机选取8000个转化子，每5个转化子接种于 一个番茄燕麦平板上，于25培养7天后，用棉签 轻轻将菌丝打断，置于光下培养，3天后用无菌水洗 下孢子，每5皿即25个转化子的孢子混合液30 mL (浓度约为每个视野3050个孢子)作为每一盒苗 的接种用量。 将44个品种催芽露白后直播于铁盘(40 cm 30 cm8 cm)内，水稻土中施用适量复合肥和尿素。 每品种穴施约1012粒。待秧苗长至34叶期接 种。接种后黑暗保湿24 h，光照56天后，采用目 测法调查记载各品种叶片上的病斑反应型。病斑反 应型的记载标准参照Valent等 的方法。 2结果与分析 21共培养后筛选方法优化 将在IM+AS固体平板上28暗培养4天的滤 纸取出，剪成2 mm宽的滤纸条，正面反贴于筛选培 养基表面，28继续培养47天。从滤纸条边缘 逐渐长出清晰可见的扇形菌落(图2)，随着培养时 间的增加，扇形菌落逐渐增多，可用灭菌牙签分批 快速挑取转化子。 植物保护学报 35卷 图2转化子在筛选培养基上的生长情况 Fig2 Growth of transformations on selection medium containing hygromycin B，cefotaxime sodium and spectinomycin 22稻瘟病菌孢子浓度对转化的影响 不同浓度的孢子液与相同浓度农杆菌共培养4 天后，产生的转化子数各不相同，共培养中均加入 AS。稻瘟病菌孢子浓度在610 4910 个 mL时，均能进行转化培养，随着孢子浓度不断升高 产生的转化子也增多，当孢子浓度升高到20 X 10 时，转化子增加不再显著(图3)，但转化效率随着孢 子浓度的增加而下降。当孢子浓度为610 个mL 时，转化效率为3290个转化子110 个孢子。当 孢子浓度为48810 个mL时，转化效率为766个 转化子110 个孢子。此浓度的混合液共培养在 硝酸纤维素膜表面，采用撕弃滤膜的方法，能挑选到 的转化子仅1028个。 槲! 较量 _薹 星 06 07 09 l-2 15 2O 23 30 49 分生孢子浓度 Spore concentration(10 mL) 图3稻瘟病菌孢子浓度对转化效率的影响 Fig3 Effect of spore concentration of CY2 on transformation rate 23共培养时间对转化的影响 在农杆菌OD 为01和分生孢子浓度为1 10 个mL时共培养，不同培养时问产生的转化子 数不同。共培养1天，筛选无转化子产生；共培养2 天，可得到少量转化子，随着共培养时间的延长，转 化率显著升高；共培养4天，平均产生3290个转化 子，转化率达到最高；继续延长培养时问，转化率逐 渐下降(图4)。 点 呈 罢 荸 r_ 圈 l 2 3 4 5 6 共培养时间Co-culturing time(d) 图4共培养时间对转化的影响 Fig4 Effect of COculturing time on transformation rate 24转化子的分子鉴定 所有参试的稻瘟病菌转化子无论是在常规CM 培养基上还是在含潮霉素的CM培养基上都能正常 生长。所有转化子均可扩增获得一条约14 kb的 片段，与从pBIG2RHPH2质粒中扩增出来的潮霉素 抗性基因片段大小相同，而以野生型菌株CY2基因 组DNA为模板时没有扩增出任何条带。转化子的 Southern blot表明，TDNA以单拷贝插入基因组的 有7个，占79，其余2个转化子的TDNA以2个或 2个以上拷贝插入(图5)。 230 kb 94 kb 65 kb 图5 Southern blot检测转化子插入拷贝数 Fig5 Determination of copy number of 9 transfornmtions by using Southern blot 注：1Marker，Hind III酶切的XDNA；210转化子。Note Lane 1： 一DNA Hind Ill marker；Lane 210：transformations 25转化子致病性突变体的筛选 将野生型菌株CY2及随机挑取8 000个转化子 分批接种在44个水稻品种上，CY2在这些品种上均 不产生任何病斑，但转化子接种后，从F801、F128一 O O O O O O O O 如 m O O 0 O O O O O 如 加 5期 吴毅歆等：一种农杆菌介导稻瘟病菌的遗传转化 425 1 C101 PKT BL23 IRBL一1 1 IRBL一3 IRBL-4 IRBL一6 1 IRBL一7 IRBL一8 IRBL-9 IRBL一10 IRBL一12 IRBL一13 IRBL一15、IRBL一17、IRBL一18、IRBL一19、IRBL一21和 3讨论 2 IRBL一24等20个品种上获得了感病型的病斑，经单 孢分离的菌株再分别接种到来源品种上，证明20个 菌株致病性发生了变异(图6)。 4 图6野生型稻瘟菌CY2与突变体14在水稻叶片上的致病性 Fig6 Pathogenicity of wild type CY2 and 14 mutants on rice leaves 影响根癌农杆菌转化真菌的因素很多，如农杆 菌菌株类型、载体启动子特异性、菌株类型等都可能 影响转化效率，不同真菌的转化效率也不相同 J。 在利用TDNA插入法构建稻瘟病菌突变体库时， Rho等 报道，每转化110。个孢子可得N5oo 1 000个转化子；李宏宇等 研究显示，每转化1 10。个孢子可得到约500个转化子；刘朋娟等 和 贺春萍等 研究显示，每转化1 x 10。个孢子获得约 300个转化子。而本研究中每转化110 个孢子 平均可获得329个转化子，效率提高了几十倍。分 析其原因，可能是所采用的农杆菌菌株和稻瘟病菌 菌株不同，导致转化效率有较大的差异。以上研究 所使用的农杆菌菌株均为AGL1 -sl，而本研究所 用菌株为C58C1。Rho等 采用的稻瘟病菌菌株是 7015；李宏宇等 采用的菌株为6ZB15、95054B、 81274和测8605；刘朋娟等 采用的菌株是Guyl1； 贺春萍等 的菌株是Y34，而本研究采用云南田间 分离的野生型菌株CY2，是无致病能力的菌株。 在转化方法上，本研究对国内外普遍采用的在 诱导培养基上铺硝酸纤维素膜 的做法进行了改 进。在过去用硝酸纤维素膜作为孢子的载体时，将 整片膜作为筛选单元，在整个平板上长出大量菌落， 当挑取转化子时，就可能把两个不同的转化子挑在 一起，或把没有被转化的孢子一起挑出。为避免非 转化子的误挑，常采用反复筛选的方法对可能的转 化子进行确认。本研究把滤纸剪成条带放置在平板 上，真正的转化子从滤纸条边缘长到培养基中间，避 免了转化子对非转化孢子的覆盖，也减少了转化子 间相互生长在一起的可能性，从而提高了转化子的 获得率 根癌农杆菌介导稻瘟病菌转化和介导植物转化 一样，也需要AS等物质的诱导，特别是在共培养阶 段，培养基中不加AS时，没有阳性菌落出现，说明 基因的诱导对TDNA向稻瘟病菌转移是必要 的。根癌农杆菌初始菌液量和稻瘟病菌分生孢子浓 度对转化均具有显著的影响，而且要保证转化获得 成功，两者都必须达到一定数值，初始菌液量或孢子 浓度过高对转化反而不利。这可能是由于农杆菌在 侵染孢子时，相对于单个孢子而言，农杆菌需要达到 一定密度才能侵染成功。研究发现，当菌液浓度 OD02时，造成共培养后抑制农杆菌生长比较 困难，农杆菌与孢子抢占营养，影响孢子的萌发，同 时增加抗生素使用成本。 本研究通过改进TDNA插入转化方法，不仅提 高了稻瘟病菌转化效率，而且还通过接种鉴定了转 化子的致病性。尽管致病性突变株的获得受到接种 量和条件的限制，但采用混合孢子液的方法接种44 个不同遗传背景的近等基因系，获得了20个致病突 426 植物保护学报 35卷 变体。由于各突变体的致病性是因插入引起的，且 来源于同一个野生型菌株CY2，突变体间属于近等 菌株。 参考文献(References) 1Krysan P J，Young J C，Sussman M RT-DNA as an insertion al mutagen in ArabidopsisPlant Cell，1999，11：22832290 2de Groot M J A，Bundock P，Hooykaas P J J，et a1Agrobacte rium tumefaciensmediated transformation of filamentous fungi Nature Biotechnology，1998，16(9)：839842 3Michielse C B，Hoykaas P J J，van den Hondel C A，et a1 Agrobacterium-mediated transformation as tool for functional ge nomics in fungiCurrent Genetics，2005，48：117 4黄亚丽，潘玮，蒋细良，等根癌农杆菌介导丝状真菌遗传 转化的研究进展生物技术通报，2007(3)：1l1114 5李宏宇，潘初沂，陈涵，等稻瘟病菌TDNA插入方法优 化及其突变体分析生物工程学报，2003，19(4)：419 423 6刘朋娟，王政逸，王秋华，等农杆菌介导的稻瘟病菌转化 及致病缺陷突变体筛选中国水稻科学，2006，20(3)：231 237 7贺春萍，林春花，廖奇亨，等稻瘟病菌TDNA插入突变 体库构建及致病相关突变体筛选热带作物学报，2007，28 (1)：8O一84 8Rho H S，Kang S，Lee Y HAgrobaetedum tumefaciensmedia- ted transformation of the plant pathogenic fungus，