检疫性有害生物——黄瓜绿斑驳花叶病毒

第16卷第2期 2009年2月 现代农业科学 Modem Agricultural Sciences V0116 No2 Feb2o09 检疫性有害生物黄瓜绿斑驳花叶病毒 吴鑫 丁元明 ，何月秋 ，李曼 ，李克海 ，王绍君 ，周 剑 (1云南农业大学植物保护学院，昆明云南650201；2云南省出入境检验检疫局，昆明云南650228) 摘要：黄瓜绿斑驳花叶病毒是烟草花叶病毒属成员之一，对葫芦科作物生产造成巨大损失。近年 来，我国葫芦科作物种子的进1：2数量逐年增加，特别是每年都要从CGMMV的发生地日本引进种子， 该病毒随进境种子传入的风险很高。笔者就CGMMV的分子生物学特性，检测方法，以及防控措施等 方面的研究结果进行了综述，望能为该病毒的检测和防治提供参考。 关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；分子生物学特性；检测方法；防控措施 中图分类号：$436421 文献标识码：A 文章编号：1oo5465O(2OO9)O2一OO87一O4 Quarantine Pathogens-Cucumber Green Mottle Mosaic Virus WU Xinu,DING Yuan-minga,HE Yue-qiul,LI Min2，LI Ke-haP,WANG Shao-jllI ZHOU Jian2 (1Conege ofPlant Protection，Yunnan Agricultural Umvemity，Kunming，Yunnan 650201，China；2Yunnan Impoand Export Inspection and Quarantine Bureau，Kunming，Yunnan 650228，China) Abstract：Cucumber green mottle mosaic virus belongs to Tobamovirus，which brought great loss tO the production of Cucur bitaceae cropsIn recent years，the import volume ofCucurbitaceae crops seeds ofour country has increased rapidly，especially seeds fire introduced from Japan yearly，the virus could be spred into our county by seeds of carting Cucumber green mottle mosaic virusIn the paper，the achievements for molecular biological chamctefistics，detection methods and control measures of Cucumber green mottle mosaic virus were reviewed，in order to provide some references Key words：Cucumber green motde mosaic virus；molecular biological characteristics；detection methods；control measures 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green motile mosaic virus，CGMMV)是葫芦科植物上的重要病毒之一，给葫芦科 作物的生产造成严重威胁。此病毒引起的病害在前苏联的格 鲁吉亚地区，发生率达80一100。20世纪90年代后对 韩国西瓜和黄瓜生产都造成重大危害。近年来，我国出入境 检疫部门曾经多次从日本进口的南瓜种子中检出CGMMV。 2005年我国辽宁大棚西瓜发生了西瓜绿斑驳病，给农民造 成惨重的经济损失。2006年北京从日本引进甜瓜种子在大 棚隔离种植的甜瓜上发生绿斑驳病毒病。河北部分地区也发 生该病害。经过检测和鉴定，这些病害均是由黄瓜绿斑驳花 叶病毒引起。2006年12月21日，农业部发布788号公告，将 黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。 该病毒因其潜在的经济影响，在国外已受到高度重视，但国 内学者对其研究不多，本人就CGMMV分子生物学特陛，检 测方法，以及防控措施等方面的研究结果进行综述，望能为 该病毒的检测和防治提供参考。 1 CGMMV病毒简介 收稿日期：20090126 基金项目：重大植物疫情检测和风险预警关键技术研究(200811(,264) 作者简介：吴鑫(1985)，女，江苏扬州人，硕士研究生 通讯作者：丁元明，研究员 11 CGMMV病毒分子生物学特性及分布 CGMMV是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员之一，首 次在黄瓜上被报道，由Ainsworth记述【1，为正单链线状RNA 病毒，病毒粒体杆状300 am x 18 nmll，基因组长度约65 k。 该病毒不同的株系在体外生物学特性有所不 31。典型株 系的稀释限点为l06；致死温度为90100；体外保毒期 119 d。碱基组成为206C，246A，316U和232G。该 病毒含有5。端和3端非翻译区，5端含帽子结构。3端具 有一个可接受组氨酸的类似tRNA状的结构。帽子结构可以 加强外壳蛋白质mRNA的稳定性和翻译效率问。CGMMV编 码区共有4个开放阅读框，分别编码129186kDa，29kDa和 173kDa4种蛋白51。186kDa蛋白是由129kDa蛋白的开放阅 读框终止子通读产生的，含有复制酶保守序列。129 kDa和 186 kDa蛋白参与病毒的复制，又称RNA依赖性RNA聚合 酶蛋白。29 kDa蛋白参与病毒在细胞与细胞之间的移动，又 称移动蛋白 。173kDa蛋白为病毒的外壳蛋白，占整个细 胞总蛋白质的10。它是病毒粒子的结构亚基，同时协同 88 现代农业科学 2009焦 介导病毒的长距离运动171。此病毒分布广泛，在希腊院里特 岛)、罗马尼亚、中国台湾、巴西(Sao Francisco地区)、前苏联、 日本、伊朗、丹麦、印度(Delhi)、芬兰、德国、英国、沙特阿拉 伯、韩国、以色列、波兰等地都有分布。 12 CGMMV的寄主及主要传播方式 CGMMV主要侵染黄瓜、西瓜、葫芦和南瓜等葫芦科作 物I1，并给它们的生产造成了严重威胁。CGMMV主要通过种 子传播嘲，也可通过花粉或接触传播，常见瓜类病毒的传播介 体蚜虫不能传播。田间病害流行借助于农事操作而扩展，一 旦病害发生，必须立即进行杀灭处理，否则土壤就会带毒。由 于此病毒能在土壤中生存很长一段时间，因此带毒土壤也可 以成为病害发生的侵染源。 13 CGMMV的分类及引起的症状特征 CGMMV病毒有6个株t91，分别为典型株系(即黄瓜绿 斑驳花叶病毒)，黄瓜桃叶珊瑚花叶株系，西瓜株系， 日本黄瓜株系，洋东株系，印度株系。表现出的症状因寄 主、环境条件及株系的不同而有差异【l1， 。黄瓜：症状表现 为叶片斑驳并凸起，畸形，造成植株矮化，果实上可产生黄或 银色条斑，果实严重受损，产量可下降15。西瓜：受侵染叶 片轻型叶斑驳，檀株矮化，果实成熟期症状严重，果实表面浓 绿色圆斑，内部出现果肉变色和腐烂。甜瓜：茎端新叶出现黄 斑，但随叶片老化症状减轻。瓠子：叶片出现花叶，有绿色突 起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。南瓜：脉绿、花叶【l51。在这六种 株系中，西瓜株系的毒性最强，西瓜一旦被侵染，就会表现出 最为严重病害症状网。 2 CGMMV的检测 国内早期检测方法主要依靠生物学性状，但该方法费时 费力，周期长，而且影响因素多，检测结果不稳定，重复性差。 建立该病毒的快速、准确、灵敏的分子检测和鉴定技术，是防 止该病毒传人国内及扩散流行的关键环节，意义重大。目 前对该病毒的检测方法有：生物学实验，电子显微镜技术，血 清学技术，分子生物学技术和芯片技术f。 等。其中比较常用 的检测技术是血清学检测和分子生物学检测。 21血清学检测 植物病毒与血清的反应有许多种，依据的原理都是基于 构成不同病毒蛋白抗原决定簇的差异与相应抗体的特异性 结合，来鉴定样品中是否含有要检测的病毒。 Kawai(1985年)等I 71使用改良ELISA(M-ELISA)检测黄 瓜种子，比标准EHSA更灵敏，能从800粒健康种子中检测 出仅有的1粒带毒种子。Choi(2001年)等“。l用DAS-ELISA 及快速免疫滤纸显色法(Rapid immuno fiher paper assay，RI PA)检测商品瓜中的病毒；后来又将RIPA发展为multiRI PA，同时检测黄瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜上的CGMMV，获得 很大成功，mu1tiRIPA法检测纯化CGMMV的最低量为50 ng，mL，因此multiRIPA法是一种简单、快速、特异、方便的 血清学检测方法。秦碧霞等n 人在广西某农业展示温室的观 赏南瓜上经DACELISA测定鉴定到该病毒分离物P一3(NN) 等。 22分子生物学检测 分子生物学技术主要是通过病毒的核酸来检测病毒，能 检测到Pg(1pg=lXlO一12g)级甚至龟级的病毒，特异性强、操 作简便、检测速度快、可用于大量样品检测I19,201。常用的分子 生物学技术主要是RT-PCR技术，免疫捕捉R，I-IPCR(Ic P 卜_PCR)，巢式PCR(Nest-PCR)，TagMan实时RT-PCR ealtime RT-PCR)等。 Kim等口，使用高密度乳胶微粒凝集试验(High density la tex particle agglutination test，HDLPAT)、ELISA、f _一PCR及生 物测定，检测葫芦种子中的CGMMV，试验结果证明，只有生 物测定可用于检测干热处理种子中的病毒；对未处理的种 子，应选用灵敏度高的R I-_PcR方法；但综合考虑样品制 备、检测费用及检测时间等因素，HDLPAT则为一种快速检 测未处理种子的实用方法。Gu _seoun Choit=rE韩国西瓜、 黄瓜、东方甜瓜、甜瓜上利用R 卜_PcR技术分离检测到 CGMMV，根据病毒外壳蛋白基因的eDNA多态性构象分析， 将36个分离物分成3个组。Yoon等哪用RT-PCR技术 明确了来自黄瓜的Kyuri green mottle mosaic vires分离物是 CGMMV中的1个株系。Varveri等I】财希腊CGMMV分离物 进行了寄主范围测定和双抗体夹心ELISA、免疫捕捉R 卜 PCR方法测定，并对3个分离物CP基因序列同源性进行比 较。在抗病毒防治方面，Park等嘴次报导了西瓜抗CGMMV 的基因工程研究，繁殖出抗CGMMV的转基因西瓜植株。陈 红运等 也利用PCR技术对辽宁盖州地区发生的黄瓜绿斑 驳花叶病毒分离物CGMMV-LN外壳蛋白基因和3非编码 区的序列进行扩增，与国外11个CGMMV分离物进行CP 基因序列同源性分析，其cP氨基酸序列同源性均高于 98，认为与其他分离物之间具有很近的亲缘关系等。 3 CGMMV的防控措施 虽然近年来未见我国关于CGMMV为害的新报道，但是 该病毒的各种葫芦科寄主在各省、市均有分布，而且周年相 衔接，其种植总面积逾3333万hmz，达到了对国家经济构 成严重威胁的风险级别，因此做好CGMMV的预防和控制十 分必要。一旦CGMMV入侵我国，并在我国定殖和蔓延，其后 果不堪设想。对CGMMV的防治措施同其他病害一样，如使 用无侵染的种苗，在农事操作中尽量避免病毒经器械等传 播，合理轮作，及时拔除初侵染病株，销毁病株残体等。其中 加强检疫、采用无毒种子，培育抗病品种和开展生物防治是 最为经济有效的预防和控制措施。 31 通过加强检疫防止病毒的扩散和蔓延 带毒种子和机械传播是CGMMV的主要传播途径，用作 砧木的感病种子也是主要侵染来源。目前这些葫芦科作物无 抗该病毒的品种，因此要加强对引进的葫芦科种子的检疫。 不能从疫区引种栽培用和砧木用的种子，疫区内的植保植检 部门应对本区内出售瓜类种子的部门逐一清查，发现带毒种 子立即销毁，同时要追查带毒种子源头并进行处理，无毒种 子包装袋上要标明检疫合格字样。此外，无论在何时、何地， 第2期 检疫性有害生物黄瓜绿斑驳花叶病毒 89 一旦发现病种和病株都要主动向植保植检部门报告，以便采 取相应措施防止其扩散蔓延。 32通过热处理对感病种子杀毒 对可能带有CGMMV的种子进行7075的热处理72 h，可使种子中病毒失活，并且几乎不影响种子发芽及种苗生 长阁。国外报道用051O盐酸、0305次氯酸钠 和10磷酸三钠溶液浸种10 min也有效果(27)。韩国科学家 (2003年)嘲曾用热处理灭活种子中的病毒，并用RT_PcR方 法检测失活病毒。 33选育抗病品种也是行之有效的抗病途径 近几年，分子育种技术发展较快。Visser等 通过cu cumis anguria和Czeyheri Sond种间杂交选育抗病品种； Daryono等291采用RAPD技术对甜瓜栽培品种的抗CGMMV 基因进行标记和抗病育种；韩国通过转入CGMMV外壳蛋白 基因获得抗病毒的西瓜砧木【 等。 34开展生物防治 现在，许多国家都在大力开展生物防治研究，并已取得 一些阶段性成果。M0t0y0shi 等采用弱毒株系(SH33b)甜瓜 进行交互保护试验；Tochihara等p 佣黄细 I03oer-havia dif- fusa)根部提取物或分离的糖蛋白防治甜瓜CGMM-V；叶子 花叶片水提取物可防治CGMMV在西红柿、甜瓜和菽麻等一 些重要经济植物上的侵染；商陆丙酮提取物KRO7O(一 种菌类多聚糖)、麦仙翁提取物也有一定的防治效果；13种蕨 类植物的提取液可抑制瓠瓜上CGMMV的活性，最高抑制率 达90；我国台湾省开发出将木霉菌施于土壤后能够有效 减轻CGMMV为害的新技术。 4问题与展望 目前对于该病毒的常用的检测技术虽然有很大的进步， 但还是存在一些问题。如ELISA技术虽然应用广泛，但是必 须依赖高灵敏度的抗血清，在实际应用过程中存在检测灵敏 度低，耗时长，容易出现假阳性结果；R 卜_PcR技术虽然灵 敏度高，但是存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应 容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，限制了植物病毒病害 样品的快速、简便、高效检测。希望病毒的检测技术能得到进 一步发展和普及，使我国的检疫系统更加完善，严格防止该 病毒传人我国，保证葫芦科作物的正常生产。 参考文献 11 HOLLINGM，K OMRUOY，TO CHIHARAHCucumber green Mot- tie mosaic virusP】Plant Viruses OnlineDescriptions and lists from the VIDE databaseAssociation ofApplied Biologists，1988，154 2种焱黄瓜绿斑驳花叶病毒导致的西瓜花叶病及其检疫性估m 植物检疫，1993，7(4)：325326， AI SHAHWAN I MAbdalla O AA strain of Cucumber green motile mosaic virus(CGMMV)from bottlegourd in Saudi Arabia册Journal ofPhytopathology。1992，134(2)：152-156 4DAWSON W O，CULVER JA Virushost interactions induction of chlorotie and necrotic responses in plants by to bamovirusesJAnnu Rev Phytopathol，19 91，29：193-217 5 SANG-MIN KIM，SANG-HYUN NAM，JUNGMYuNG LEEet a1 Destruction of Cucumber Green Motile Mosaic virus by Heat Treat- ment and Rapid Detection of Virus inactivation by RTPCRJ】 Molecules and Cells，2003，16(3)：338-342 6】UGAKI M，TOMIYAMA M，KAKUTANI T，et a1The complete nucleotide sequenceof Cucumber green motile mosaic virus(SH 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of Two Tobamovirus Diseases in Cucurbits and Control Measures in Korea叨Plant Pathology Jour- nal，2004，17(5)：243248 23】YOON J Y，MIN B E，CHOI S H，RYU K HCompletion of nn eleotide sequence and generation of highly infectious transcripts to cueurbits from full-length eDNA clone of Kyuri green mottle m0- saic v