枯草芽孢杆菌植酸酶的研究进展

第 21卷 第 6期 云 南 农 业 大 学 学 报 Vol1 21 No162006年 12月 Journal of Yunnan Agricultural University Dce. 2006收 稿 日 期 : 2006 - 03 - 31 3 基 金 项 目 : 云 南 省 应 用 基 金 资 助 (2000C0052M )。 3 3 通 讯 作 者作 者 简 介 : 范 继 英 (1979 - ) ,女 ,云 南 建 水 人 ,硕 士 研 究 生 ,主 要 从 事 枯 草 芽 孢 杆 菌 基 因 工 程 研 究 。枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 研 究 进 展 3范 继 英 , 何 月 秋 3 3(云 南 农 业 大 学 ,农 业 生 物 多 样 性 与 病 虫 害 控 制 教 育 部 重 点 实 验 室 ,云 南 昆 明 650201)摘 要 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 通 能 过 分 泌 植 酸 酶 分 解 植 酸 ,释 放 磷 元 素 ,促 进 动 植 物 磷 的 吸 收 。 主 要 综 述 了 枯 草 芽 孢 杆菌 植 酸 酶 作 用 机 理 、 酶 学 性 质 、 分 离 纯 化 、 分 类 地 位 和 基 因 工 程 方 面 的 研 究 进 展 ,以 便 为 该 酶 的 深 入 研 究 和 应 用提 供 借 鉴 作 用 。关 键 词 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 ; 植 酸 ; 植 酸 酶中 图 分 类 号 : S 432142; Q 55 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1004 - 390X (2006) 06 - 0715 - 06Brief Review of Secreted Phytases from B acillus subtilisFAN J i2ying, HE Yue2qiu(The Key Laboratory for Agricultural Biodiversity for PestManagement of China Education M inistry, Y A U, Kunming 650201, China)Abstract: B acillus subtilis can hydrolyze phytate, release phosphorus and imp rove phosphorus nutritionof p lants and animals by secreting phytases. This review briefly summarizes the research p rogress onphytases from B acillus subtilis in effect mechanism , p roperty, isolation, purification and taxonomy ofthe enzyme and gene engineering to speed up the deep research and exp loitation of the enzyme.Key words: B acillus subtilis; phytate; phytases植 酸 酶 是 催 化 植 酸 及 植 酸 盐 水 解 产 生 肌 醇 和磷 酸 (或 磷 酸 盐 )的 一 类 酶 的 总 称 1 。 植 酸 酶 广 泛地 分 布 于 植 物 性 饲 料 中 。 虽 然 研 究 真 菌 分 泌 植 酸酶 较 多 ,但 近 几 年 来 的 研 究 发 现 细 菌 也 能 分 泌 植 酸酶 。 产 生 植 酸 酶 的 细 菌 主 要 有 枯 草 芽 孢 杆 菌 (B a2cillus subtilis)、 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (B. am yloliquefa2ciens)、 大 肠 杆 菌 ( Escherichia coli)、 乳 酸 杆 菌 (L ac2tobacillus spp. )、 链 球 菌 ( S treptococcus spp. )、 肠 杆菌 ( Enterobacter spp. )、 克 雷 伯 菌 ( Klebsiella spp. )、假 单 孢 杆 菌 ( Pseudom onas spp. )等 2 6 。 NELSON等 首 次 证 明 了 微 生 物 植 酸 酶 能 够 水 解 饲 料 中 的 植酸 磷 ,释 放 磷 元 素 7 。 这 一 发 现 大 大 推 动 了 微 生物 植 酸 酶 的 研 究 进 程 。 大 量 研 究 表 明 ,不 同 来 源 的植 酸 酶 的 作 用 机 理 和 酶 学 性 质 存 在 很 大 差 异 。 由于 许 多 枯 草 芽 孢 杆 菌 具 有 良 好 抑 制 丝 状 植 物 病 原真 菌 和 促 进 植 物 生 长 的 作 用 ,在 农 业 生 产 中 起 作 越来 越 重 要 作 用 。 它 们 除 产 生 植 物 激 素 、 蛋 白 酶 、 淀粉 酶 、 脂 酶 外 ,还 产 生 植 酸 酶 以 及 其 他 丰 富 的 代 谢产 物 促 进 植 物 生 长 。 此 外 ,由 于 植 酸 酶 在 饲 料 业 中的 广 泛 应 用 价 值 ,枯 草 芽 孢 杆 菌 来 源 的 植 酸 酶 研 究也 越 来 越 深 入 和 取 得 了 长 足 进 展 。1 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 作 用 机 理植 酸 酶 水 解 植 酸 是 分 步 进 行 的 。 植 酸 酶 将 植酸 分 子 上 的 磷 酸 基 团 逐 个 切 下 ,形 成 肌 醇 五 磷 酸 酯至 肌 醇 一 磷 酸 酯 不 同 的 中 间 产 物 ,最 终 产 物 是 肌 醇三 磷 酸 与 一 些 无 机 磷 8 。 但 不 同 来 源 的 植 酸 酶 其作 用 机 理 不 完 全 相 同 。 KEROVUO等 9 利 用 高 效液 相 色 谱 法 (HPLC)分 析 了 芽 孢 杆 菌 PhyC酶 学 反应 的 峰 值 ,以 植 酸 化 学 水 解 产 物 为 对 照 ,反 应 开 始时 ,植 酸 的 峰 值 记 为 Peak I;酶 学 反 应 10 m in后 ,肌醇 - (1, 2, 4, 5, 6)五 磷 酸 为 主 要 产 物 ,伴 有 少 量 的肌 醇 - (1, 2, 3, 4, 5)五 磷 酸 肌 醇 - (1, 2, 3, 4, 6)五磷 酸 、 肌 醇 - (2, 4, 5, 6)四 磷 酸 和 肌 醇 - (1, 2, 3,5)四 磷 酸 ;反 应 30 m in后 ,植 酸 ( Peak I)和 肌 醇 -(1, 2, 4, 5, 6)五 磷 酸 的 峰 值 降 低 ,而 肌 醇 - ( 2, 4,5, 6)四 磷 酸 和 肌 醇 - ( 1, 2, 3, 5)四 磷 酸 的 峰 值 上升 ;反 应 90 m in后 ,只 有 一 种 主 要 的 肌 醇 三 磷 酸 峰值 ( Peak A ) , Peak A有 可 能 是 肌 醇 - (1, 3, 5)三 磷酸 或 者 肌 醇 - (2, 4, 6)三 磷 酸 ,在 Peak A的 两 侧 微凸 表 明 产 物 中 还 包 含 有 少 量 的 肌 醇 - ( 1, 4, 5)三磷 酸 。 KEROVUO等 根 据 这 一 试 验 结 果 并 结 合 计算 机 模 拟 得 到 了 植 酸 酶 水 解 植 酸 的 模 型 ,他 们 认 为植 酸 首 先 通 过 第 2位 和 第 4位 磷 酸 结 合 在 酶 的 浅裂 缝 侧 翼 ,第 3位 磷 酸 因 面 对 活 性 部 位 而 被 切 割 ,释 放 出 肌 醇 - (1, 2, 4, 5, 6)五 磷 酸 中 间 产 物 ;接 着肌 醇 五 磷 酸 再 通 过 第 2位 和 第 6位 磷 酸 结 合 至 裂缝 侧 翼 ,第 1位 磷 酸 面 对 活 性 部 位 而 被 切 割 ,形 成肌 醇 - (2, 4, 5, 6)四 磷 酸 ;同 理 ,形 成 的 肌 醇 - (2,表 1 已 分 离 克 隆 到 的 植 酸 酶 基 因Tab. 1 Phytase genes isolated from m icroorganism s来 源origin编 码基 因geneORF长 度 /bplengthof OR氨 基 酸 个 数N o. Am inoacid理 论 分 子 量 /Dmolecularweight最 适 pHop timumpH value最 适 温 度 /op timumtemperatureRHGXRXP位 点Site of RHGXRXP氨 基 酸 序 列同 源 性 /%aa homology黑 曲 酶 N RRL3135,AL K0243 12 - 14 A spergillus n iger ( ficuum )NRRL3135, AL K0243phyA 1 506 467 51 075 2. 5, 5. 5 55 有 100黑 曲 霉 96315 A . n iger 963 phyA 1 506 467 51 142 1. 8, 5. 7 57 有 92构 巢 裸 孢 壳 16 Em ericella nidu lans phyA 1 446 463 51 785 - - 有 63棉 状 嗜 热 丝 孢 菌 17 Therm om yces lanuginosus phyA 1 481 474 51 920 6. 0 75 有 48酵 母 菌 18 S accha rom yces cerevisiae phyA 1 283 461 51 560 2. 7, 5. 0 70 有 18黑 曲 霉NRRL3135, ALK024312 A spergillus n iger ( ficuum )NRRL3135, AL K0243phyB 1 616 479 52 611 2. 5 55 有 20大 肠 杆 菌 19 Escherichia coli appA 1 299 432 - 2. 5 3. 5 55 有 19玉 米 20 Zea m ays PHYS11 1 167 388 41 662 4. 8 55 有 5大 豆 21 S oybean GmPhy 1 644 547 - 4. 5 5. 0 58 无 -地 衣 芽 孢 杆 菌 22 B. licheniform is phyL 1 146 381 - 6. 0 65 无 -枯 草 芽 孢 杆 菌 23 B acillus subtilis phyC 1 152 383 41 802 7. 0 55 无 6注 :“ - ” 表 示 未 报 道 。 “ - ” shows no related report。4, 5, 6)四 磷 酸 仍 然 能 结 合 到 植 酸 酶 的 浅 裂 缝 侧翼 ,五 磷 酸 面 对 活 性 部 位 被 切 割 后 形 成 肌 醇 - 2, 4,6 -三 磷 酸 ;而 肌 醇 - 2, 4, 6 -三 磷 酸 已 没 有 磷 酸 可面 对 活 性 位 点 ,因 此 肌 醇 - 2, 4, 6 - 三 磷 酸 水 解 植酸 酶 的 终 产 物 。 如 果 植 酸 是 通 过 第 1位 和 第 3位磷 酸 结 合 到 植 酸 酶 浅 裂 缝 侧 翼 ,植 酸 水 解 终 产 物 将为 肌 醇 - 1, 3, 5 -三 磷 酸 。2 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 酶 学 性 质不 同 来 源 的 植 酸 酶 的 酶 学 性 质 不 同 (表 1 )。大 部 分 植 酸 酶 最 佳 活 性 所 需 的 pH值 范 围 在 2. 06. 0之 间 ,为 酸 性 植 酸 酶 ,最 适 温 度 值 在 53 70 。因 此 ,酸 性 植 酸 酶 主 要 适 用 于 pH值 呈 酸 性 的 单 胃动 物 ,如 猪 、 禽 及 少 数 鱼 类 ,但 不 适 于 消 化 道 呈 中 性的 鲤 科 鱼 类 。 植 酸 酶 的 这 种 适 用 于 酸 性 胃 动 物 的特 点 ,限 制 了 植 酸 酶 应 用 范 围 和 该 行 业 的 发 展 。 但枯 草 芽 孢 杆 菌 的 植 酸 酶 呈 中 性 3 。 王 亚 茹 等 10 研617 云 南 农 业 大 学 学 报 第 21卷究 发 现 ,植 酸 酶 的 最 适 温 度 为 55 ,在 pH 710715范 围 以 外 ,酶 活 性 下 降 较 快 。 胡 勇 等 11 发 现酶 的 最 适 pH为 7. 0 ,但 在 pH 6. 0 8. 0范 围 内 活性 都 较 高 ,接 近 最 大 值 。 从 稳 定 性 来 看 ,该 酶 在 pH6. 0 10. 0之 间 稳 定 。 王 亚 茹 等 10 分 析 阳 离 子 对植 酸 酶 活 性 的 影 响 发 现 ,枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 生物 学 活 性 依 赖 Ca2 + 的 存 在 , 并 且 Fe2 + , Co2 + ,Mn2 + , Cu2 +等 金 属 离 子 对 植 酸 酶 活 性 均 有 不 同 程度 的 抑 制 作 用 。3 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 PhyC的 分 离 纯 化王 亚 茹 等 10 报 道 的 植 酸 酶 PhyC的 分 离 方 法是 :将 样 品 稀 释 涂 布 于 细 菌 营 养 肉 汁 平 板 上 ,在28 下 培 养 2 3 d后 , 挑 取 单 菌 落 至 含 植 酸 钙 的筛 选 平 板 上 , 30 培 养 3 d, 挑 取 产 生 透 明 消 解 圈的 菌 株 即 能 分 离 得 到 产 生 植 酸 酶 的 菌 株 。 但 有 些细 菌 可 能 因 产 生 酸 性 代 谢 产 物 而 出 现 消 解 圈 ,产 生假 阳 性 现 象 。 因 此 ,必 须 进 一 步 测 定 菌 株 的 植 酸 酶活 性 以 确 定 其 是 否 产 生 了 植 酸 酶 。植 酸 酶 活 性 的 测 定 方 法 是 将 菌 株 于 细 菌 营 养 肉汁 液 体 培 养 基 上 30 振 荡 培 养 过 夜 后 ,按 10%的 接种 量 于 1 L WBE培 养 基 (100 g麸 皮 加 到 900 mL水中 , 121 处 理 1 h, 8层 纱 布 过 滤 ,滤 液 定 容 到 1 L,加入 014 g (NH4 ) 2 SO4 , 012 g MgSO4 7H2O, 0105 gKH2 PO4 , 0104 g K2 HPO4 , 2 g CaCl2 , 10 g Casitone,115%琼 脂 , pH 615) 30 300 r/m in振 荡 培 养 4 d,每 12 h取 5 mL培 养 液 离 心 取 上 清 液 用 于 测 定 酶 活性 。 取 012 mL酶 稀 释 液 加 入 018 mL 1125 mmol/L的 植 酸 钠 (用 含 1 mmol/L CaCl2 的 0125 mmol/L Tris- HCl(pH 715)配 制 ) 37 保 温 30 m in,加 入 1 mL10% TCA终 止 酶 反 应 后 ,再 加 入 2 mL硫 酸 亚 铁 -钼酸 氨 显 色 液 , 700 nm测 定 无 机 磷 含 量 。 以 每 分 钟 释放 出 1 mol无 机 磷 所 需 的 酶 量 定 义 为 一 个 酶 活 性单 位 来 计 算 酶 的 活 性 。据 王 亚 茹 等 10 报 道 ,枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的纯 化 均 在 4 下 进 行 。 将 培 养 4 d的 培 养 液 离 心 后去 菌 体 , 在 上 清 夜 中 加 入 CaCl2 至 终 浓 度1 mmol/L,再 加 入 3倍 体 积 无 水 乙 醇 ,混 匀 后 于- 20 过 夜 。 离 心 后 的 沉 淀 用 - 20 乙 醇 洗 涤 2次 ,冷 冻 干 燥 后 重 悬 于 含 100 mL 1 mmol/L CaCl2的 Tris - HCl(pH 715)缓 冲 液 中 ,加 入 硫 酸 铵 至 饱和 度 65% , 4 过 夜 ,离 心 取 上 清 ,加 入 硫 酸 铵 至 饱和 度 85% ,重 悬 于 上 一 步 所 述 缓 冲 液 中 。 所 得 到的 植 酸 酶 蛋 白 进 一 步 用 HPLC进 行 纯 化 得 到 纯 酶 ,总 回 收 率 为 18% ,纯 化 倍 数 为 1 000。 1998年 KIM等 人 5 报 道 ,除 了 快 速 蛋 白 液 相 色 谱 ( FPLC)外 其余 步 骤 均 在 4 进 行 , CaCl2 终 浓 度 为 1 mmol/L。在 植 酸 酶 粗 提 液 中 加 入 等 体 积 的 丙 酮 搅 拌 30 m in后 放 置 1 h,吸 去 上 清 后 ,剩 余 液 体 离 心 去 上 清 ,沉淀 中 加 入 20 mL 10 mmol/L Tris - HCl(pH 710) ,离心 ,加 入 硫 酸 铵 至 终 浓 度 为 115 mmol/L,酶 溶 液 经苯 基 琼 脂 糖 凝 胶 柱 处 理 后 ,再 用 线 性 梯 度 下 降 的 硫酸 铵 进 行 洗 脱 ,然 后 加 入 MES (pH 610)缓 冲 液 的酶 液 进 行 透 析 处 理 ,转 至 Resource S柱 进 行 洗 脱 ,洗 脱 后 的 酶 液 加 入 同 样 缓 冲 液 后 用 0 015 mol/L线 性 梯 度 的 NaCl再 洗 脱 ,最 后 通 过 Superose 12HR 10 /30进 行 纯 化 。 总 回 收 率 为 10% ,纯 化 倍 数为 77倍 。从 上 述 两 组 试 验 来 看 ,植 酸 酶 的 纯 化 条 件 是 :(1)纯 化 要 求 在 4 低 温 下 进 行 ; ( 2) Ca2 +的 存 在是 必 要 的 ; (3)多 步 洗 脱 和 浓 缩 。4 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 分 类 地 位从 NCB I和 USA等 数 据 库 信 息 分 析 ,水 解 植 酸的 酶 可 分 为 3类 :组 氨 酸 酸 性 磷 酸 酶 ( histidine acidphosphatase)、 螺 旋 植 酸 酶 ( - p ropeller phytase)和 紫 酸 磷 酸 酶 (purp le acid phosphatases) 24 。 许 多真 菌 分 泌 的 植 酸 酶 都 属 于 组 氨 酸 酸 性 磷 酸 酶 。 来源 于 丝 状 真 菌 , 尤 其 是 曲 霉 的 phyA基 因 (表 1) ,无 论 在 核 苷 酸 来 源 、 编 码 的 氨 基 酸 序 列 等 基 因 结 构上 , 还 是 在 基 因 产 物 的 酶 学 性 质 上 均 有 较 高 的 相似 性 ,而 且 都 具 有 组 氨 酸 酸 性 磷 酸 酶 保 守 活 性 位 点(RHGXRXP) 25 ,都 属 于 组 氨 酸 酸 性 磷 酸 酶 家 族 。而 大 肠 杆 菌 植 酸 酶 基 因 appA编 码 双 功 能 酶 且 含有 RHGXRXP序 列 ,也 将 其 归 为 组 氨 酸 磷 酸 酶 家族 。 大 多 植 物 具 有 紫 酸 磷 酸 酶 ,该 酶 为 同 源 二 聚 体糖 蛋 白 ( homodimeric glycop rotein ) ,且 有 一 个 Fe( III) - Zn ( II)活 性 位 点 26 。然 而 ,来 源 于 芽 孢 杆 菌 的 植 酸 酶 编 码 基 因 较短 , 编 码 蛋 白 的 分 子 量 也 较 小 , 它 的 核 苷 酸 序 列及 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 phyA 和 phyB 及 已 报 道 的酸 性 磷 酸 酶 基 因 没 有 同 源 性 , 也 没 有 普 遍 存 在 于717第 6期 范 继 英 ,等 :枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 研 究 进 展phyA 和 phyB 编 码 蛋 白 上 的 活 性 位 点 保 守 序 列RHGXRXP,不 属 于 组 氨 酸 酸 性 磷 酸 酶 家 族 ,而 属 于 螺 旋 植 酸 酶 。 螺 旋 植 酸 酶 具 有 6向 折 叠 构 象 的 结 构 ,每 个蛋 白 分 子 具 有 6个 Ca2 +绑 定 位 点 ,植 酸 酶 的 活 性依 赖 于 Ca2 +的 存 在 。 但 是 ,不 同 来 源 的 芽 孢 杆 菌植 酸 酶 性 质 也 相 互 区 别 。 将 不 同 来 源 的 芽 孢 杆 菌植 酸 酶 的 DNA序 列 进 行 比 对 (表 2) ,发 现 源 于 地衣 芽 孢 杆 菌 的 植 酸 酶 基 因 phyL与 源 于 枯 草 芽 孢 杆菌 VTTE - 68013的 植 酸 酶 基 因 phyC、 源 于 解 淀 粉芽 孢 杆 菌 的 植 酸 酶 基 因 TS - phy在 蛋 白 水 平 上 的同 源 性 分 别 为 67%和 65% ,与 枯 草 芽 孢 杆 菌 168的 植 酸 酶 基 因 phyA的 同 源 性 为 69% ,而 phyC与TS - phy间 的 同 源 性 完 全 一 致 。表 2 已 克 隆 到 的 芽 孢 杆 菌 属 植 酸 酶 基 因Tab. 2 Phytase genes isolated from B acillus来 源origin编 码 基 因geneORF长 度 / bplength ofORF氨 基 酸 个 数N o. Am inoacid理 论 分 子 量 / Dolecularweight最 适 pHop timumpH value最 适 温 度 /op timumtemperature蛋 白 质 水 平 同 源性 3 / % Proteinhomology枯 草 芽 孢 杆 菌VTTE - 68013 3 B acillus subtilisVTTE - 68013phyc 1 152 383 41 802 7. 0 55 67枯 草 芽 孢 杆 菌 23 B acillus subtilis nphy 1 152 383 41 802 7. 0 55 67枯 草 芽 孢 杆 菌 168 22 B acillus subtilis 168 168phyA 1 149 382 NR 6. 0 55 69解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 6 B. am y loliqueficiens TS - phy 1 152 383 41 808 NR 70 65地 衣 芽 孢 杆 菌 22 B. licheniform is phyL 1 146 381 NR 6. 0 65 -3 表 示 与 地 衣 芽 孢 杆 菌 编 码 的 植 酸 酶 蛋 白 相 比 ; NR表 示 未 报 道 。3 shows the homology at p rotein level compared with phytase secreted by B. licheniform is. NR : no report。5 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 基 因 工 程5. 1 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 基 因 结 构从 表 1可 以 看 出 ,来 源 于 丝 状 真 菌 的 植 酸 酶 编码 基 因 比 源 于 芽 孢 杆 菌 的 基 因 长 ,其 编 码 的 氨 基 酸数 在 460 480之 间 。 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 基 因phyC全 长 1 290 bp,其 主 要 的 ORF全 长 1 152 bp,编 码 383个 氨 基 酸 , 其 N端 的 前 26个 氨 基 酸 为 信号 肽 ,切 割 位 点 位 于 + 26位 的 A la之 后 23 。 phyC含 有 一 个 - 35 序 列 ( TTGACA )、 一 个 - 10 序 列( TAACAC) 和 一 个 核 糖 体 结 合 位 点 。 核 糖 体 结 合位 点 含 9个 核 苷 ,即 AAGGAGGAA, 其 中 有 一 保 守序 列 GGAGG。 终 止 子 ( TAA )位 于 一 个 二 重 对 称茎 环 结 构 的 后 面 中 止 转 录 3 。 而 枯 草 芽 孢 杆 菌168的 植 酸 酶 基 因 168phyA的 ORF为 1 149 bp,只编 码 382个 氨 基 酸 22 。5. 2 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 转 基 因 技 术近 年 来 ,随 着 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 基 因 研 究 的白 热 化 ,枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 基 因 克 隆 也 越 来 越引 起 人 们 的 关 注 。KEROVUO 等 3 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 VTTE -68013植 酸 酶 基 因 转 入 大 肠 杆 菌 ,后 者 表 达 了 植 酸酶 的 活 性 ,新 表 达 的 植 酸 酶 的 酶 学 性 质 与 天 然 的 植酸 酶 相 同 。 YIP等 24 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 基 因转 入 烟 草 ,在 磷 酸 盐 限 制 条 件 下 ,转 基 因 烟 草 植 株形 态 学 和 生 理 学 指 标 都 得 到 了 显 著 提 高 ,降 解 产 生的 磷 酸 盐 足 以 维 持 植 株 的 生 长 ,而 且 植 酸 酶 的 表 达水 平 持 续 地 稳 定 在 较 高 水 平 。王 红 宁 等 27 根 据 枯 草 芽 孢 杆 菌 WHNB02 植酸 酶 phyC基 因 全 序 列 设 计 一 对 引 物 ,采 用 PCR技术 法 从 含 有 该 基 因 的 pUC182phyC质 粒 上 获 得 不含 有 信 号 肽 序 列 的 phyC基 因 表 达 片 段 ,亚 克 隆 到毕 赤 巴 斯 德 表 达 载 体 pP IC9K的 多 克 隆 位 点 , 并 电转 化 毕 赤 巴 斯 德 酵 母 GS115。 经 MD 和 MM 平 板筛 选 、 酶 活 性 测 定 ,获 得 了 阳 性 转 化 子 PP9KC。 首次 在 毕 赤 巴 斯 德 酵 母 中 实 现 了 有 生 物 学 活 性 的 枯817 云 南 农 业 大 学 学 报 第 21卷草 芽 孢 杆 菌 植 酸 酶 的 分 泌 性 表 达 。6 结 束 语众 所 周 知 ,植 酸 酶 是 近 年 来 出 现 的 一 种 新 型 绿色 添 加 剂 ,它 催 化 植 酸 水 解 产 生 肌 醇 和 无 机 磷 酸盐 ,消 除 植 物 性 饲 料 或 食 品 中 植 酸 的 抗 营 养 作 用 ,提 高 机 体 对 蛋 白 质 及 多 种 微 量 元 素 的 利 用 率 ,促 进生 长 发 育 ,减 少 粪 便 或 土 壤 中 磷 的 残 留 量 ,从 而 降低 磷 对 环 境 造 成 的 污 染 6 。 以 黑 曲 酶 NRRL3135等 为 代 表 的 酸 性 植 酸 酶 ,仅 适 合 于 pH呈 酸 性 的 单胃 动 物 ,在 应 用 上 存 在 局 限 性 。枯 草 芽 孢 杆 菌 分 泌 的 植 酸 酶 在 催 化 机 理 、 酶 学性 质 、 分 类 地 位 及 基 因 结 构 等 方 面 都 与 传 统 的 酸 性植 酸 酶 相 区 别 ,属 于 中 性 植 酸 酶 。 这 一 新 型 的 植 酸酶 可 在 pH为 中 性 的 肠 道 中 起 作 用 ,提 高 了 植 酸 酶在 动 物 的 胃 肠 道 的 效 用 ,从 而 弥 补 了 酸 性 植 酸 酶 性质 上 的 不 足 ,拓 宽 了 植 酸 酶 的 应 用 范 围 。 此 外 ,植酸 酶 基 因 的 克 隆 和 转 植 酸 酶 基 因 植 物 的 应 用 ,有 望提 高 植 物 的 磷 营 养 状 况 。参 考 文 献 1 NELSON T S, SH IEL T R, W EODZINSKI R J, et al. .The availability of phytate phosphorous in soybean beforeand after treatment with a mold phytase J . 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