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第39卷 2012征 第3期 6月 植物保护 学报 ACTA PHYT0PHYLACICA SINICA Vo139 No3 June 2012 烟草黑胫病拮抗根际芽胞杆菌FB16的 筛选鉴定及其抑茵活性 冯志珍 陈太春 段军娜 陈德鑫 成巨龙 安德荣 (1西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;2中国 烟草总公司青州烟草研究所,青岛266001;3中国烟草总公司陕西省烟草研究所,西安710061) 摘要:为获得对烟草黑胫病有较强生防效果的拮抗细菌,从健康烟草根际采集30份土壤样品,分 离纯化得到347株细菌,经病原真菌定向筛选后得到1株对烟草黑胫病菌等病原真菌拮抗活性较 好的细菌FB 16,其对烟草黑胫病菌的抑菌带宽为23mm。采用菌丝生长速率法、作用机制试验、温 室防病试验测定FB一16的抑菌作用,并通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对菌 株进行鉴定。结果显示,菌株FB16发酵液对烟草黑胫病菌菌丝生长抑制率为9596;其代谢产 物对烟草黑胫病菌菌丝有致畸作用;菌株FB-16为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliauefaciens(Gen Bank登录号为JN245982);饱和度25硫酸铵获得的抑菌物质对烟草黑胫病菌的抑茵活性较高, 抑菌圈直径达4200mm;FB16活性产物处理的烟草植株在接种烟草黑胫病菌7天后的防治效果 为6996。表明菌株FB16在烟草黑胫病生物防治中具有潜在的利用价值。 关键词:烟草黑胫病菌;根际细菌;抑菌活性;防治效果 Screening,identification and antifungal activity of antagonistic rhizospheric Bacillus FB16 against tobacco black shank Feng Zhizhen Chen Taichun Duan Junna Chen Dexin Cheng Julong An Derong (1College of Plant Protection,Nohwest A&F University,Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Yangling 712100,Shaanxi Province,China;2Qingzhou Tobacco Research Institute,China National Tobacco Croporation,Qingdao 266001,Shandong Province, China;3Shaanxi Tobacco Research Institute,China National Tobacco Corporation,Xian 710061,Shaanxi Province,China) Abstract:In order to get a strong effect biocontrol bacteria for tobacco black shank,347 bacteria strains were isolated from 30 soil sampleswhich collected from healthy tobacco rhizospheric soilFB16,a strain with strong effect on Phytophthora nicotianae。its inhibition zone was up to 23 mmThe methods of inhibition rate of mycelium growth,antifungal mechanism experiment,bonsai experiment in greenhouse were used to determine its antifungal effectThis strain was identified based on morphological,physiolog ical and biochemical characteristicsand 16S rDNA phylogenetic analysisThe results showed that the inhibition rate of FB16 fermented liquid against the mycelium growth of Pnicotianae was 9596The FB一16 metabolite showed teratogenic effects on mycelia of PnicotianaeThe strain FB一16 was identified as Bacillus amyloliauefaciens(GenBank accession JN245982)The antifungal metabolite from stain FB一 基金项目:高等学校学科创新引智计划(NoB07049),国家“863”计划(2007AA021503),中国烟草有害生物普查项目(KJ一2010-04) 作者简介:冯志珍,女,1986年生,硕士研究生,研究方向为微生物资源利用,email:fzz870508126eom 通讯作者(Auther for coespondence),email:anderong323163conl 收稿日期:20110908 3期 冯志珍等:烟草黑胫病拮抗根际芽胞杆菌FB-16的筛选鉴定及其抑菌活性 1 6 extracted by 25ammonium sulfate showed the most effective inhibition toward Pnicotianae,and its inhibition zone diameter was up to 4200 mmIn the 7th day after treated with FB一16,the control effect Oil tobacco reached 6996Conclusively,it has potential value in biological control against to bacco black shank Key words:Phytophthora nicotianae;rhizobacteria;antifungal activity;control efficacy 烟草黑胫病是由烟草疫霉Phytophthora nicoti anae Brada de Hann引起的土传真菌性病害,俗称 “黑根”、“黑杆疯”,多发生于成株期,少数在苗床期 发生。幼苗染病时茎基部出现污黑色病斑,茎杆染 病时茎基部初呈水渍状黑斑,严重时植株萎蔫死亡, 该病平均发病率为5一12,重者损失达75,甚 至绝收 J。我国平均每年因烟草黑胫病造成的经 济损失达1亿元以上,仅次于烟草病毒病 。J。 烟草黑胫病自发现以来,引起了国内外学者的 广泛关注,并对病害症状、病原物生物学特性、病害 的发生发展规律、预测预报及防治措施等进行了大 量研究。Broadbent_6 研究表明,烟草黑胫病菌的拮 抗细菌有假单胞杆菌Pseudomonas spp和芽胞杆菌 Bacillus spp,该拮抗菌通过产生抗菌素使烟草黑胫 病菌菌丝溶解。English&Mitchell【 研究显示,在 田间土壤中加入拮抗细菌,可以显著降低烟草黑胫 病菌的侵染机会,从而减少发病率。王清海等 从 土壤中筛选到能使烟草黑胫病菌和辣椒疫霉病菌菌 丝畸变、菌丝壁消解的链霉菌Streptomyce spp,其发 酵液的热稳定性和酸碱稳定性较强,在2055、 pH值39都具有抑菌活性。 有关以烟草根际定向筛选的芽胞杆菌防治烟草 黑胫病的研究鲜有报道,为此,作者对烟草种植区根 际土壤进行拮抗细菌的分离筛选和抑菌作用测定, 对抑菌效果显著的菌株进行菌株鉴定、活性产物的 提取,并利用其粗提物进行温室防病试验,以期为防 治烟草黑胫病提供生防资源。 1材料与方法 11材料 植物病原真菌:烟草黑胫病菌P ophthora nic, otianae、番茄灰霉病菌Botrytis cirerea、苹果轮纹病菌 Physalospora piricola、小麦根腐病菌Bipolaris sorokin iana、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum fspvasin。 rectum、稻瘟病菌 cularia oryzae,除烟草黑胫病菌 分离自烟草病株上外,其它植物病原真菌均由西北 农林科技大学植物病害综合治理实验室提供。 土壤样品:采自陕西省陇县高发病地块烟草健 株的根际。 培养基:LB固体培养基用于分离和保存根际细 菌;LB液体培养基用于发酵根际细菌;燕麦培养基用 于培养烟草黑胫病菌;PDA培养基用于对峙培养。 烟叶品种:苏晒097,由陕西省烟草研究所提供。 药剂:58甲霜锰锌(metalaxyl mancozeb)可 湿性粉剂,江苏宝灵化工股份有限公司生产。 12方法 121根际细菌的分离与筛选 细菌分离采用平板稀释法 J,称取1 g土壤样 品,加入玻璃珠、吐温、石英砂振荡和研磨根段,用 无菌水稀释成1 X 10、110、1 X 10、1 X 10、 110、110 的悬浮液,置220 rmin摇床振荡5 rain。取025 mL上清液,用三角玻璃棒在PDA平板 上涂抹均匀。倒置于32恒温培养箱中培养57 天。观察菌落生长情况,将单菌落挑出,纯化培养。 初筛采用抑菌圈法 J,首先挑取烟草黑胫病菌 菌丝制成菌悬液,将菌悬液与融化并冷却至45 qC左 右的PDA培养基混匀,制平板。挑取30 活化培 养24 h的供试细菌点接于烟草黑胫病菌平板上,28 培养34天后,观察抑菌带大小。 复筛采用牛津杯法 ,将初筛得到的菌株分别 接种于装有50 mL液体LB培养基的三角瓶中,32 、220 rmin振荡培养48 h。收集培养液于4、 10000 rmin离心,将上清用022 m微孔滤膜过滤 除菌。在病原菌平板上等距离放置4个牛津杯,每 杯中接入不同菌株的无菌培养滤液5O L,28培 养72 h,测量抑菌圈直径。 122抑菌活性测定 拮抗细菌发酵液对菌丝生长的抑制率:采用生 长速率法 ,将发酵液经10 O00rmin离心过滤, 022 Ixm微孔滤膜过滤除菌,在无菌条件下,按无菌 发酵液与培养基1:9的比例与冷却至45左右的 PDA培养基混匀,并制成含无菌发酵液的平板培养 基,在每个培养基中央放入1个直径5 mm的病原菌 菌饼,28恒温培养34天后,采用十字交叉法测 植物保护学报 39卷 量菌落直径,计算菌丝生长抑制率。 抑制率()=(对照生长直径一处理生长直 径)对照生长直径100 以加同样比例的无菌水的培养基为对照,每处 理3次重复。 发酵液活性物质对菌丝的抑制作用:采用平板 对峙法 ,在PDA平板中央接病原菌菌饼,在距平 板中心3 cm的四周接拮抗菌株,3O倒置培养3 天。观察靠近拮抗菌的抑菌圈边缘菌丝生长情况, 以远离拮抗菌的边缘菌丝为对照,显微镜观察拮抗 细菌活性产物对病原菌菌丝形态的影响。 123拮抗细菌的鉴定 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定 参照柳凤等 。 16S rDNA基因序列测定及其系统进化树的构建 参照Todorov等 ,提取细菌基因组DNA为模板,以 F27(5 一TACGGTACCTTG1_rACCACT一3 )和R1492(5 一 CTGAGCCAGGATCAAACT-3 )为上、下游引物扩增 菌株的16S rDNA。PCR产物经1琼脂糖凝胶电 泳检测后送上海生工生物工程有限公司进行序列测 定。登陆NCBI网站,将测序结果用BLAST软件进 行同源性比较,提交注册登录号。以Clustal X进行 多序列比对后,用MEGA 40的NeighborJoining法 构建系统发育树,并进行1 000次Bootstraps检测。 124 FB 16抑菌物质的提取 将拮抗细菌FB一16接种到LB液体培养基中, 对照为LB液体培养基,28、150 rmin振荡培养 24 h,10000 rmin离心20min,去菌体,加入不同质 量的硫酸铵,使硫酸铵饱和度分别为10、20、 25、30、35、40、50、6O、70、80、 90、100,4下静置沉淀24 h,弃上清,沉淀用 25 mmolL磷酸缓冲液溶解,透析脱盐后与烟草黑 胫病菌对峙培养,36 h后用滤纸片法 测定抑菌圈 直径。 125温室防病试验 刮下在燕麦培养基上培养7天的黑胫病菌菌 丝,加入01KNO 溶液浸泡,加无菌水搅碎,8 下放置20 rain后稀释10倍,加入1葡萄糖后备 用。将拮抗细菌粗提物制备成001 gmL的活性产 物粗提液。盆栽试验使用灭菌菜地土,装入10 cm 10 cm的盆栽钵中,移栽后在接黑胫病菌前5天灌施 拮抗细菌粗提液,每次每株10 mL。对照药剂58 甲霜锰锌可湿性粉剂以500倍液于接种黑胫病菌 前24 h灌根,每株10mL,设清水处理为空白对照, 每个处理15株,3次重复。当烟苗长至67片真 叶时接种烟草黑胫病菌,每株1O mL,接种前用少量 清水润湿土壤。处理后将植株置于20黑暗条件 下24 h,再置于28室温培养。7天后调查烟草植 株发病情况,统计发病率和病情指数,计算相对防治 效果。防治效果()=(对照病情指数一处理病 情指数)对照病情指数10016。 126数据分析 采用SPSS 160软件中的Duncan氏新复极差 法对所有数据进行单因素分析。 2结果与分析 21烟草根际拮抗细菌的筛选 采集烟草根际土壤样品30份,分离得到347株 细菌。以烟草黑胫病菌、番茄灰霉病菌、苹果轮纹病 菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌6种真 菌为供试植物病原真菌,初筛拮抗细菌109株,通过 发酵液抗性复筛,发现其中48株的拮抗作用较为明 显,培养72 h后,对各病原菌抑菌带宽均在7 mm以 上。其中菌株FB一16对6种病原真菌的拮抗活性较 好,抑菌带宽均在15 mm以上,对烟草黑胫病菌的抑 菌带宽为23 mill,与苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、 棉花枯萎病菌、稻瘟病菌均达显著差异(表1)。 22菌株FB-16发酵液对菌株生长的抑制率 菌株FB一16发酵液对烟草黑胫病菌、番茄灰霉 病菌、小麦根腐病菌、稻瘟病菌的抑制率达到90 以上,其中对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率达 9596,说明菌株FB16抑菌效果较好(表1)。 23菌株FB-16对菌丝生长的抑制作用 菌株FB一16分泌产生的次生代谢物使得植物病 原真菌的菌丝顶端和分枝处较为膨大;菌丝分枝增 多,粗而短;菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀, 浓缩成不规则体,部分菌丝内原生质有流出形成空 壳的现象(图1一a)。对照菌丝生长细长而均匀,细 胞结构较为清晰,并无膨大畸形现象(图1b)。 24菌株FB一16的鉴定 241培养性状、形态学特征及生理生化特征 拮抗细菌FB16为革兰氏染色阳性菌,在LB固 体培养基上菌落呈圆形、不光滑、不透明、边缘不规 则、表面褶皱,菌落呈乳白色至黄色,具有一定的粘附 性。显微镜下观察,菌体呈杆状,长约2 ILm,单生,周 生鞭毛,可形成内生芽胞,芽胞呈椭圆形(图2)。 植物保护学报 39卷 表2菌株FB-16的生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain FB一16 测试项目 结果 测试项目 结果 Test item Resalt Test itern Result 接触酶Peroxidase + 柠檬酸盐Citrate solution + 葡萄糖产气Glucose gas production 一 生长温度Growth temperature() 10 淀粉水解Starch hydrolysis + 3O + 吲哚试验IPAtest 一 5O + 硝酸盐还原Nitrate reduction + 55 一 甲基红试验Methyl red + pH 44 VP试验VPtest + 57 + 明胶液化Hydrolysis of gelatin + 8O + 硫化氢H2S production 一 95 一 丙二酸盐Malonate utilize 一 NaC1 5 + 蔗糖Sucrose + 7 + 氧化酶Oxidase + 1O + 葡萄糖Glucose + 15 一 注:+:阳性反应;一:阴性反应。Note:+:Positive;一:negative 47 58 39 4o【 38 86 97厂Bacillus vireti(AJ542509) 100 1 Bacillus novalis(AJ542512) I广Bacillus batavlens(AJ542508) 5 1 L Bacillus soil(AJ5425 1 3) 10O Bacillusjeotgali(AF22 1 06 1) Bacillus thioparans(DQ371431) Bacillus methanolicus(ABt12727) Bacillus shackletonii(AJ2503 1 8) 一Bacillus marisflavi(AF483624) 10O Bacillus atrophaeus fAB021181) FB一16(JN245982) 100k Bacillusamyloliquefaciens(HQ840645) Bacillus litoral&(AY608605) 100 Bacillusfusiform&(AF169537) Bacillus neidei(AF169520) Bacillus bogoriensis(A3763 12) Bacillus barbarus(AJ422145) O01 Bacillus chitinolyticus(AB045 100) 图3菌株FB-16的系统进化树 Fig3 Evolutional tree of strain FB一16 生化特征及16S rDNA序列分析结果,菌株FB-16为 解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliauefaciens。 25菌株FB-16抑菌物质的抑菌活性 菌株FB16能够分泌胞外抑菌物质,饱和度为 35及35以上时无沉淀析出,即对烟草黑胫病菌 无抑菌活性,而饱和度10一30硫酸铵获得的抑 菌物质对烟草黑胫病菌均具有抑菌活性,但抑菌活 性不同,其中,饱和度25硫酸铵获得抑菌物质的 抑菌圈直径较大,即抑菌活性较高(表3)。 26菌株FB-16活性物质的温室防病效果 菌株FB16活性产物粗提液处理的烟草植株在 接种烟草黑胫病7天后的发病率为4333,病情 指数为2792,防治效果为6996;而对照药剂 5 8甲霜锰锌可湿性粉U5oo倍液处理的发病率 3期 冯志珍等:烟草黑胫病拮抗根际芽胞杆菌FB一16的筛选鉴定及其抑菌活性 表3不同饱和度硫酸铵获得FB-16抑菌物质的抑菌活性 Table 3 Antifungal activity of ammonium sulfate precipitation of the antagonists from strain FB一1 6 硫酸铵饱和度() 抑菌圈直径(Bin) 硫酸铵饱和度() 抑菌圈直径(mm) Ammonium sulfate Diameter of Ammonium sulfate Diameter of saturation c0ncentrati0n inhibition zone saturation concentration inhibition zone lO 3533153 B 50 20 3867153 AB 60- 25 4200100 A 70 30 3633153 B 80- 35 90- 40 l0O 一 注:表中数据为平均值标准差。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P001水平差异显著。Note:The data are meanSDThe different letters in the same column show significant difference at P001 level by DuncanS new muhiple range test 为3667,病情指数为2292,防治效果为7534 (表4)。说明拮抗菌FB一16对烟草黑胫病有较好的 预防效果,菌株FB16及其代谢产物可以作为生防 制剂应用于烟草黑胫病的防治。 表4菌株FB16对烟草黑胫病的温室防治效果 Table 4 Control efficacy of strain FB-16 on tobacco black shank in greenhouse 注:表中数据为平均值标准差。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P0叭水平差异显著。Note:The data are meanSDThe different letters in the same column show significant difference at P001 level by DuncanS new multiple range test 3讨论 本研究从健康烟草根际土壤中分离筛选得到1 株对烟草黑胫病菌等病原真菌拮抗活性较好的细菌 FB一16。菌株FB-16分泌产生的次生代谢物对烟草 黑胫病菌菌丝生长的致畸作用,一方面与发酵液中 活性物质能够抑制病原菌正常生长的菌体蛋白的合 成有关,另一方面与拮抗菌产生的某些溶菌酶有 关 。温室盆栽试验显示,菌株FB一16活性产物对 烟草黑胫病有明显的防治效果,在烟草黑胫病生物 防治中具潜在的利用价值。 经细菌学和分子生物学分类鉴定,菌株FB一16 为解淀粉芽胞杆菌Bamyloliauefaciens,且对多种病 原菌有较强的抑制作用。该抑制作用与FB-16产生 了某种拮抗物质有关,故用不同饱和度硫酸铵对菌 株FB16抑菌物质进行粗提,结果显示饱和度25 硫酸铵获得的抑菌物质抑菌活性最高,表明该抑菌 物质可能是某种蛋白质。 何建清等 研究表明,在诱发产孢过程中,受 到培养基种类、光照、变温处理及菌株等多种因素的 影响。本研究中,烟草黑胫病菌在PDA培养基及燕 麦培养基上均未产生孢子,因此温室盆栽试验采用 菌悬液接种病原菌,故其防效结果与大田有一些 出入。 从不同作物根际分离筛选出有益根际细菌,再 施用于作物根部是生防研究的一条捷径。目前,国 内外对烟草黑胫病生防菌株的研究多集中于木霉的 研究上,对芽胞杆菌的研究相对较少 。从抗逆 性、定制能力以及生防效果等方面考虑,芽胞杆菌的 研究价值比木霉高。本研究对菌株FB16菌丝形态 进行了观察,其核酸、蛋白质、细胞壁以及与抗病相 关的酶活性变化等还有待于进一步研究。 参考文献(References) 1孔凡玉,朱贤朝,石金开,等我国烟草侵染性病害发生趋势 及防治对策中国烟草,1995(1):3134 230 植物保护学报 39卷 2王清海,万平平,李安娜,等土壤拮抗链霉菌R一(15)菌 株发酵产物的抑菌作用中国农学通报,2006,22(2): 327330 3陈瑞森,朱贤朝,王智发,等全国16个主产烟省(区)烟草 侵染性病害调研报告中国烟草科学,1997,1(4):17 4蔡勇,肖启明,杜桂萍烟草黑胫病生物防治的研究进展 安徽农业科学,2010,38(11):57085710,5743 f5马国胜,高智谋,陈娟烟草黑胫病研究进展烟草科技, 2001(9):4448 6Broadbent PBacteria and actinomyctes antagonistic to fungal root pathogens in Australian soilAustralianumal of Biologi cal Sciences,1971,24:925944 7English J T,Mitchell D JRelationship between the develop ment of root systems of tobacco and infection by Phytoph thora parasitica varnicotianaePhytopathology,1988,78: 14781483 8Niemann H,Losekann

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