香樟茎段组培快繁技术

第42卷第4期 201 5年1 2月 福 建 林 业 科 技 Jour of Fujian Forestry Sci and Tech Vo142 No4 Dec，2 0 1 5 doi：1013428jenkifjlk201504028 香樟茎段组培快繁技术 张椿芳 ，王建军 ，何月秋 (1宁波城市职业技术学院，浙江宁波315100；2宁波林业局林特种苗繁育中心，浙江宁波315012) 摘要：以多年生香樟茎段为外植体，进行丛生芽的诱导和快速繁殖试验。结果表明：无菌茎段接种至Ms+6-BA 05 mg L +IBA 007 mgL 的诱导培养基中，腋芽明显萌动并伸长展叶，且萌发率为100；在MS+6-BA 05 mgL +NAA 005 mgL 可形成大量丛生芽，平均有效芽数可达52个；在12 MS+IBA 005 mgL 生根培养基中培养20 d后，丛 生芽全部生根，移栽成活率可达90。 关键词：香樟；茎段；组织培养；再生体系 中图分类号：$7231 326 文献标识码：A 文章编号：10027351(2015)04012805 Study on Tissue Culture and Plant Regeneration of Cinnamomum caphora ZHANG Chun-fang ，WANG Jian-jun ，HE Yue-qiu。 (1Ningbo City College of VocationalTechnology，Ningbo 315100，Zhefiang，China； 2Breeding Center of Specialty Forest Seedlings，Ningbo Forestry Bureau，Ningbo 315012，Zhejiang，China) Abstract：A micropropagation protocol was developed for Cinnamomum caphora using as initial explant nodal segments from newly e merged laterals of treesThe results showed that bud inducement was initiated on a MS medium containing 05 mgL。6一BA and 007 mgLIBAThe inducement rate of valid buds reached to 100The shoots were subcuhured and multiplied on an improved MS medium containing 05 mgL一 6一BA and 005 mgL一 NAA and the effective bud per shoot was 52Harvested shoots were rooted in vitro in 12 MS supplemented with 005 mgLIBA for 30 days and the rooting rate was 100The survival rate was 90when the rooting shoots were moved to the greenhouse Key words：Cinnamomum caphora；nodal segments；tissue culture；plant regeneration 樟树(Cinnamomum caphora)又名香樟，为樟科樟属的亚热带常绿阔叶乔木，广泛分布于中国、日本，同 时作为园林树种和资源树种被引种到多个国家种植。其生长迅速，枝繁叶茂，四季常绿，叶形秀丽而又散 发浓香，既是珍贵的芳香油类树种又是城市重要的景观和绿化树种。同时香樟种子遗传物质不稳定，后代 可分化出多种基因型，经过选育可形成多种新品种。目前获得国家授权的品种涌金 、霞光系种子 变异后代，具有较高的观赏价值，但是涌金、霞光母株仅有1株，需要通过无性繁殖方法保持其遗传 特性并扩大其数量。然而，扦插和嫁接繁殖方式的成活率低。普通香樟资源丰富，开展其组培研究可为变 异品种的组培技术开发提供借鉴。目前国内外对香樟组培研究取得了一定的成果，国内一些学者分别利 用香樟伐根萌条 _。、不同龄期的茎段 、茎尖 ” 、种子 H、离体胚 、幼十 、嫩芽 等作为外植 体进行了组织培养研究工作并诱导出完整植株；KNirmal Babu等 l_也报道香樟茎段组织培养技术的研 究成果，目前虽然有不少香樟组织培养获得成功的报道，但不同学者间的观点还存在一定的分歧，对香樟 的组培体系的建立对成年香樟组培再生体系中增殖环节出现落叶 J、生根率不高等问题，尚需加强其高 效组培再生体系建立的研究，为进一步规模化生产提供技术支持。 收稿日期：2014121l；修回日期：20150225 基金项目：宁波市林业科技项目(2011105)；浙江省宁波市科技局农业攻关项目(2007C10009) 作者简介：张椿芳(1977一)，女，贵州石阡人，宁波城市职业技术学院讲师，从事植物组织培养研究。Email：zhangchun fangnbcccno 通讯作者：何月秋。Email：heyueqiunbccen。 第4期 张椿芳，等：香樟茎段组培快繁技术 1材料与方法 11试验材料 2014年8月于宁波市林业局种苗中心邱隘基地采集腋芽尚未萌发的多年生的香樟新梢，带回试验室 备用。 12试验方法 121 外植体的处理取香樟发育充实、半木质化的侧梢和顶梢部分，去除叶片，剪成带有12个腋芽 的茎段，用洗洁精清洗4-5 min，流水冲洗30 rain以上。在超净工作台上用75的酒精消毒3 min，无菌 水冲洗3次，再用01升汞根据茎段直径大小消毒812 min，无菌水冲洗45次。滤纸吸干水分，切 去茎段褐化部分，接种至MS培养基中，选择无菌材料进行腋芽诱导试验。 122外植体诱导试验 以MS作为基本培养基添加不同类型的植物生长调节剂6一BA 05、 0、20 mgL；IBA 005、007，01 mgL。采用不同浓度的正交组合形式，以筛选出适宜的腋芽诱导培养 基，每个试验号接种30个茎段，重复3次，30 d以后观察腋芽生长情况。 123增殖试验以MS为基本培养，添加6-BA 05、10、30 mgL；NAA 002、005，010 mgL。 采用不同浓度正交组合形式，以筛选出适宜的腋芽继代与增殖的培养基，每个试验号接种3O个芽茎段，重 复3次，30 d统计腋芽增殖与增殖形成的丛生芽的生长情况。 124 生根试验选择培养瓶中生长一致、茎芽高20 cm的幼苗进行生根试验。以12 MS为基本培养 基添加IBA 005、007、01 mgL，每处理接种30株试管苗，重复3次，30 d统计丛生芽的生根及生长 情况。 13培养条件 经过灭菌处理后的离体材料培养于10 mL的试管中，得到无菌材料后接种至诱导培养基中进行培养。 诱导、增殖的基本培养基为Ms，白糖为30 gL；生根基本培养基为12 MS，白糖为15 gL。所有培 养基pH值均为58，培养温度(25 4-1) ，光照强度为40 Imo|m。s，光照时间为12 hd。 14数据分析 萌发率=腋芽生长外植体数接种外植体数100；平均有效芽数=30 d统计总芽数接种芽数(高 度为1 em以上为有效芽)；生根率=生根苗数接种苗数100。数据采用平均值标准误(sE)表示， 采用SPSS 170统计软件对数据进行统计，均值比较采用单因子方差分析，不同处理方式显著差异性采用 Duncan s新复极差测验方法(SSR，P1 mgL、IBA01 mgL 时香樟茎段腋芽的诱导率降 低、茎段切口形成愈伤组织，进而褐化、死亡。当6一BA为05 mgL、IBA为00501 mgL 时，香 樟茎段腋芽均可全部萌发，与其他组合相比，萌芽率达到显著水平(P007 mgL 时萌发的腋芽出现新叶脱落，不利于进一步发育。综合分析表明， 培养基MS+6-BA 05 mgL +IBA 007 mgL 较为适合香樟腋芽的启动培养。 ：不同字母为差异显著(P005，Duncan s新复极差检验)。下同。 22腋芽增殖 由表2可知，香樟腋芽在诱导培养基中继代时丛生芽难以增殖，同时容易出现叶片死亡、生长势逐渐 衰弱进而出现死亡的现象。而在添加不同浓度的6-BA和NAA的培养基中，腋芽增殖形成的丛生芽可正 常生长。当NAA为002010 mgL，6-BA为05 mgL 时腋芽可大量增殖，平均有效芽数最高可 达到52；6一BA增加到1 mgL 时，虽然平均有效芽数有所提高，最高可达到54，显著高于6-BA为05 mgL、3 mgL 时的平均有效芽数(P005)，但切口基部愈伤组织增加，分化的丛芽变得细小，严重 的出现叶片脱落和褐化；当6一BA增加到3 mgL 时，平均有效芽数急剧下降，愈伤化严重，丛芽发育不 良夹杂死苗，表明高外源植物生长调节剂不利于香樟丛生芽的继代与增殖。不同培养基配方对腋芽增殖 效果进行分析表明，在培养基MS+6-BA 05 mgL +NAA 005 mgL 中腋芽增殖达到的平均有效芽 数可达到52以上，且形成的丛生芽生长状态好。因此，该培养基是香樟腋芽适宜的继代与增殖培养基。 试验发现，香樟丛生芽在增殖培养基中反复继代6次以上，切口处容易形成大量白色膨松的愈伤组织，同 时出现畸形苗和死苗，需要与无NAA的培养基隔代交替使用，以分化出更多生长正常的丛生芽，以保证增 殖体系。 表2不同植物生长调节剂组合对丛生芽增殖的影晌 132 福建林业科技 第42卷 3结论与讨论 目前有不少香樟组织培养获得成功，多数研究者在香樟组培过程中选用的基本培养基为MS、改良 MS、12 MS并按照不同的培养阶段进行相应的调整，在腋芽诱导和增殖阶段所使用的植物生长调节剂及 浓度范围为6一BA(12 mgL )和NAA(00505 mgL )；继代与增殖阶段6BA(35 mgL ) 和IBA(0201 mgL )，对于最佳浓度组合不同学者的观点存在一定的分歧_2 ，这可能与外植体采 集的时间、树龄、基因型等诸多因素有关。本研究中香樟在再生体系建立过程中使用的基本培养基与其他 学者基本一致，而使用的植物生长调节剂种类和浓度则表现出差异。本研究结果显示，香樟腋芽对NAA 非常敏感，低浓度即可使得切口处、叶柄与茎段连接处产生大量愈伤组织并且茎段过于膨大，而MS+6 BA 05 mgL +IBA 007 mgL 有利于香樟腋芽诱导与生长；在腋芽继代与增殖阶段6-BA与IBA的 组合容易导致腋芽的生长势衰弱，而MS+6一BA 05 mgL +NAA 005 mgL 则有利于腋芽的继代与 增殖。同时在腋芽生长与增殖过程中最常见的问题是新生嫩芽褐化且嫩叶从上到下发生坏死现象，这与 李乾振等 和索长江等 报道的一致。李乾振等 和索长江等 在研究普通香樟组培时认为添加 NaH PO 50 mgL 可降低此现象的发生，本研究则通过调整植物生长调节剂的种类及浓度可以避免。 整个培养过程表明，高浓度的植物生长调节剂容易导致腋芽的愈伤化并明显抑制其发育，但本试验中香樟 丛生芽生长较慢，如何改善这一现状并提高香樟组培体系的高效性尚需进一步研究。在生根阶段，丛生芽 在添加有IBA 005 mgL 的培养基中组培苗的生根率可达到100。 参考文献： 1王建军香樟新品种“涌金”J林业科学，2010，46(8)：181 2连芳青，熊伟，张露樟树茎段离体培养和植株再生J江西林业科技，1992(3)：20-21 3李乾振，吴丽君，陈碧华，等芳樟工厂化育苗技术研究J福建林业科技，2001，28(4)：2124 4张梅坤，刘荣忠，曾陆三纯种芳樟的组织培养技术J中国花卉园艺，2003(10)：25 5彭东辉脑樟组织培养技术研究J福建林学院学报，2005，25(4)：313317 6王长宪，刘静，黄艳艳，等山东抗寒香樟组培快繁体系的建立J山东农业大学学报：自然科学版，2006，37(4)： 513516 7吴幼媚，王以红，蔡铃，等香樟优良无性系快繁技术的研究J广西农业生物科学，2006，25(1)：6064 f8辜夕容，黄建国，杨庆香樟离体培养体系的构建初探J中国农学通报，2005，21(5)：97100 9武芸香樟愈伤组织的诱导和改良J湖北民族学院学报：自然科学版，2010，28(2)：216218 10辛全伟香樟优良无性系的繁殖技术研究D福州：福建农林大学，2010 11郑红建香樟组培快繁技术研究J林业科技开发，2012，26(1)：103105 12唐国涛，张汉永，朱昔娇樟树组织培养试验J福建林业科技，2013，40(6)：7072 13索长江，蔡斌华香樟丛生芽的诱导和快速繁殖研究J林业科技开发，1997(3)：2930 f 14田华英香樟组培快繁和再生体系的建立及植物表达载体pCAMB1A2300一ACA的构建D曲阜：曲阜师范大