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第40卷第1期 2013年 2月 植物保护 学报 ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA Vo140 No1 Feb 2013 抗烟草青枯病菌的芽胞杆菌筛选和鉴定 Screening,identification of antagonistic rhizospheric Bacillus sp LW-6 against tobacco bacterial wilt 刘伟沈小英段军娜牛小义宋双安德荣 (西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100) Liu Wei Shen Xiaoying Duan Junna Niu Xiaoyi Song Shuang An Derong (State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Plant Protection, Northwest AF University,Yangling 712100,Shannxi Province,China) 烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌Ralatonia SO lanacearum引起的一种土传病害J。此病是热带、 亚热带地区烟草的主要病害之一,在我国长江流域 及其以南烟区普遍发生,其中以广东、福建、湖南、四 川及贵州烟区危害较重 。 烟草青枯病自发现以来,引起了国内外学者的 广泛关注。目前,在生产中主要采用化学农药防治, 但是仍无法有效防止该病发生,而且容易产生抗药 性和造成环境污染。生物防治具有无污染、无公害 和长效性等优点,在植物病害的防治中占据越来越 重要的位置。李清飞等 从福建烟田根际土壤中 分离出5株对烟草青枯病有明显抑制作用的细菌。 Lemessa&Zellerl4 从埃塞俄比亚烟田根际土壤中筛 选出6株对烟草青枯病有明显拮抗作用的细菌。本 研究对烟草种植区根际土壤进行拮抗细菌的分离筛 选和鉴定,以期为防治烟草青枯病提供生防资源。 1材料与方法 11材料:土样:从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中 等地的健康烟草土壤中采集土样30份。培养基: TYC培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,LB液体培养基, BPA固体培养基,NA固体培养基,NA拮抗菌突变 株回收培养基:对应NA培养基中加入0O1氯化 三苯基四氮唑。供试菌株:烟草青枯病菌RSO lanacearum由西北农林科技大学植物病害综合治理 实验室提供。 12拮抗芽胞杆菌的分离:称取烟草根际土壤10 g, 倒入装有90mL灭菌水的锥形瓶中,160 rmin振荡 20 min,80 水浴30 min,10倍稀释,涂布分离。纯 化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色,显示菌体呈杆 状、产芽孢、革兰氏染色阳性的分离物为芽胞杆 菌 。拮抗芽胞杆菌的筛选:用TTC培养基选择具 有活性的烟草青枯病菌作为指示菌,将烟草青枯病 菌配成210 CFUmL浓度的菌悬液,转接到BPA 培养基上,制成青枯病菌含菌培养基。在平板中央 接上述己分离纯化的芽胞杆菌菌株,30培养23 天,测定抑菌圈直径和抑菌带的大小。 13拮抗芽胞杆菌的鉴定:菌体形态、培养特征观 察及生理生化指标测定参照柳凤等 方法。16S rDNA基因序列测定及其系统进化树的构建参照 Todorov等 。提取细菌基因组DNA为模板,以7f (5 CAGAG r GATCCTGGCT一3 )和1540r(5 一AG GAGGTGATCCAGCCGCA3 )为上、下游引物扩增菌 株的16S rDNA。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳 检测后送往上海生工生物工程有限公司进行序列测 定,测序结果用BLAST软件在GenBank进行同源性 比较。以Clustal X进行多序列比对后,用MEGA 50的NeighborJoining法构建系统发育树,并进行 1 000次Bootstraps检测。 2结果与分析 21拮抗细茵的筛选结果 从采集的30份土壤样品中,分离得到780株芽 胞杆菌。通过对所分离的芽胞杆菌进行拮抗初筛, 得到抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-6,抑菌圈 直径为2105 mlTl,抑菌带宽为837 mm。 22 LW一6菌株鉴定 培养性状、形态学特征及生理生化特征:在NA 基金项目:高等学校学科创新引智计划(NoB07049),国家“863”计划(2007AA021503) 作者简介:刘伟,女,1987年生,硕士研究生,研究方向为微生物资源利用,E-mail:weiweipeng3800006163corn 通讯作者(Authorfor correspondence),Email:anderong323163con;收稿日期:20120910 96 植物保护学报 40卷 固体培养基上LW-6菌落呈现奶白色,菌落表面粗 糙,边缘呈现锯齿状,透射电镜显示Lw一6呈杆状, 革兰氏阳性,周生鞭毛,单个细胞大小为0506 m2025 m(图1)。菌株LW一6可以使明胶 液化;能水解淀粉和还原硝酸盐;葡萄糖、阿拉伯 。 糖、木糖、甘露糖、接触酶、脂肪酶、脲酶及氧化酶均 呈阳性;VP试验为阳性;不利用柠檬酸盐。生长 温度为1060,最适生长温度为3O o(=;pH值为 30110,最适为70;具有耐盐性,可以在15 的NaC1培养基中生长。 图1透射电镜和扫描电镜下LW-6菌株形态 Fig1 The transmission and scanning electron microscopy images of LW一6 strain 16S rDNA序列分析与系统进化树构建:以Lw一 6基因组DNA为模板,用引物7f和1540r进行PCR 扩增,测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1 454 bp,GenBank登录号为JX220980。通过与NCBI 中模式菌株的16S rDNA序列比对分析和系统发育 树的构建,LW一6菌株与甲基营养型芽胞杆菌Bacil lus methylotrophicus CBMB205(T)(GenBank登录号 为EU194897)同源性最近,相似性为100。综合 菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16S rDNA 序列分析结果,Lw-6菌株为甲基营养型芽胞杆菌 Bmethylotrophicus(图2)。 0005 图2菌株Lw-6的系统进化树 Fig2 The evolutional tree of strain LW一6 参考文献(References) 1彭细桥,刘红艳,罗宽,等烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选 和初步鉴定中国烟草科学,2007,28(2):3840 2陈瑞泰,朱贤朝,王智发,等全国16个主产烟省(区)烟草 侵染性病害调研报告中国烟草科学,1997(4):17 3李清飞,李红丽,王岩,等烟草青枯病病原菌的分离及其拮 抗菌的筛选河南农业科学,2006(1):5153,79 4Lemessa F,Zeller WScreening rhizobacteria for biological control of Ralstonia solanacearum in EthiopiaBiological Con一 6630) tro12007,42(3):336344 5马志远,李金岭,冯志珍,等一株烟草赤星病拮抗芽胞杆菌 的鉴定与活性研究西北农林科技大学(自然科学版), 2012,40(3):117125 6柳凤,欧雄常,何红,等红树内生细菌AmS2菌株对芒果炭 疽病的抑制作用植物保护学报,2010,37(5):453458 7Todorov S D,Meincken M,Dicks L M TFactors affec

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