陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定

成巨龙等 陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定 植物保护 陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定 成巨龙 ，罗晶2，5-I5航 ，柯美福 ，牛俞德 ，安德荣 1陕西省烟草公司，西安710061： 2西北农林科技大学，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100 摘要：2013年7月在陕西省西乡县韩岭村烟田首次发现疑似烟草青枯病病株，为了解陕西烟草青枯病的发生危害，对陕西省 不同烟区的烟草青枯病的发生情况进行系统调查，并对田间采集的具有典型青枯病症状的烟草茎部样本进行了病原鉴定。结果表 明：陕西省烟草青枯病发生区域为陕南的汉中、安康和商洛3个烟区，延安、宝鸡和咸阳的三个烟区尚未发现。发病始于6月上 旬，盛发于7月中旬。该病害随温度升高而病情加剧，发病早期田间死苗严重，发病率可高达2467，而且有蔓延扩展趋势； 通过对烟草茎秆上分离的病原细菌进行形态观察、致病性测定、生理生化性状等常规细菌鉴定比较，结合细菌16S rDNA序列分析， 鉴定该病原菌为青枯劳尔氏菌Ralatonia solanacearum。 关键词：烟草青枯病；病原鉴定；青枯劳尔氏茵 doi：lO3969jissn1004-5708201405014 中图分类号：S43 文献标志码：A 文章编号：10045708(2014)050087-06 dentification of tobacco bacterial wilt pathogen in Shaanx CHENG Julong ，LUO Jing ，ZOU Hang ，KE Meifu ，NIU Yude ，AN Derong 1 Shaanxi Provincial Tobacco Company，Xian，7 1 006 1，China； 2 State Key Laboratory of Crop Biology Adversity in Arid Regions，Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling，Shaanxi 7 1 2 1 00，China Abstract：Tobacco bacterial wilt in Shaanxi was investigated using samples typical of wilt symptomsResults showed that bacterial wilt occurred in tobacco growing areas of southern Shaanxi province including Hanzhong，Ankang and ShangluoNo bacterial wilt disease was observed in other tobacco growing areas such as Yanan，Baoji and XianyangIt broke out in early June and prevailed in the middle of July,indicating that it aggravated in line with rising temperature(with incidence of up to 2467)Morphology observation，pathogenicity determination，physiological and biochemical identification in combination with 1 6S rDNA sequence analysis showed that the pathogen was Ralatonia solanacearum Keywords：tobacco bacterial wilt；identification ofpathogen；Ralatonia solanacearum 烟草青枯病是一种严重危害烟草生长和品质的顽 固性细菌病害，烟草感病后会造成严重产量和质量损 失。该病常发生在热带、亚热带及部分温带地区。目 前我国该病主要在长江流域及其以南烟区普遍发生， 其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、 安徽南部、四川、云南及贵州局部烟区为害严重1-21， 个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。由于温室 基金项目 作者简介 收稿日期 陕西烟草有害生物调查(KJ 201004) 成巨龙(1959一)研究员，主要研究方向为烟草病害 Tel：02985466136，Email：julongc126con 2O130922 效应的加剧，该病的发生危害有向北方烟区扩展的趋 势，目前在山东、河南及辽宁等省相继有发生报道l3】， 且局部地区危害较重。陕西地处中国内陆腹地，黄河 和长江流域中部，陕西烟田青枯病的发生、危害和症 状特点及发病规律等尚无报道。本文针对上述问题， 结合全国烟草有害生物第二次调查要求，对烟草青枯 病在陕西的发生情况、症状和病原菌鉴定进行了系统 研究。 1材料 培养基：LB固体培养基(胰蛋白胨10 gL，酵 中国烟草学报2014年10月第20卷第5期 母浸粉5 gL，NaC1 10 gL，琼脂1520 gL)；TTC 培养基(胰蛋白胨17 gL，大豆胨3 gL，NaC1 25 g L，葡萄糖6 gL，硫乙醇酸钠05 gm，L一胱氨酸025 L，亚硫酸钠01 gL，琼脂1520 L，pH 7201)。 供试烟草：NC89。IQ5定量PCR仪，美国伯乐公司 产品；DK一8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器 有限公司产品；DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪 特分析仪器有限公司产品；CP100WX超速离心机， 日本日立公司产品；H61微型电泳槽，上海精益有 机玻璃制品仪器厂产品；Gel Doe XR 凝胶成像分析 系统，美国BIORAD公司产品；NICOLET300紫外 分光光度计，美国热电公司产品；3130XL DNA自动 测序仪，美国ABI公司产品；DV805A TaKaRa胶回 收试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司。 2方法 21病害调查和样本采集 在2010-2013年全国烟草有害生物第二次调查 时，在陕西6个地区18个不同生态条件的烟田进行 采样和调查，其中在陕西省汉中、安康和商洛烟区均 发现有典型烟草青枯病症状的烟株。在田问切取8 cm 左右感病茎杆，装入封口塑料袋中带回进行病原分离、 鉴定。 采取定点观察的方法，选择陕西省安康市旬阳县、 宝鸡市陇县、汉中市西乡县、延安市富县、咸阳市旬 邑县以及商洛市镇安县等烟田进行病害系统调查。首 先在烤烟旺长期进行大田观察，发现病株后进行定点 定株定时观察，选取同一地点的100株病株，每隔3 d观察发病情况，至收获。其次，在大田烟草青枯病 病情基本稳定后进行一次病情调查，了解大田中烟草 的发病情况，采用对角线五点取样法，每个点选取50 株，统计田间发病率。 22 病原分离和纯化 分离病菌前，将茎秆冲洗干净，用75的酒精 对茎秆和小刀消毒，然后在无菌条件下，用小刀剖开 茎秆上的病斑，将感病维管束组织切成若干小块，用 无菌的镊子夹取烟块于直径为10 cm的含LB固体培 养基的培养皿中，每个皿中放45块，重复3次，培 养温度为2830，培养48 h4，待烟块于培养基 接触处长出白色流动性菌落并且向外分散细小丝状菌 块时，挑取菌落少许，在TTC培养基上划线分离， 每个样本挑取呈典型的青枯劳尔氏菌落形态(中央呈 粉红色、周围乳白色、流动性较强)的单菌落在TTC 培养基上划线纯化。 2-3致病性测定 供试烟草品种为NC89。在盆钵内将烟草种子播 种后，待烟株生长到有维管束组织时(5-6片叶)， 用小刀在烟草茎基部切一斜口，用胶头滴管将事先培 养好的病原菌悬液滴在开口处，并用蘸有菌液的棉球 包在伤口处、烟苗外套保鲜袋保湿。以灭菌水作对照， 过一段时问观察发病状况【4。 24病原鉴定 241 病原菌的生理生化特性 取培养18 h的细菌单菌落，涂于载玻片上进行 负染色，电镜下观察菌体的形态大小、鞭毛特性；菌 体的菌落特征及生理生化指标测定参考常见细菌系 统鉴定手册【5。菌落形态主要观察单菌落形状、大小、 颜色、表面、边缘、隆起特性、透明度等。生理生化 主要进行糖类发酵试验、石蕊牛乳试验、明胶液化试 验、硝酸盐还原试验、吲哚及氨的产生试验、乙酰甲 基甲醇试验、产生硫化氢试验、淀粉水解试验8个指 标。 242 病原菌16S rDNA序列的测定 从已进行致病性测定的菌株中选出致病性最强 的菌株进行16S rDNA测序，以f27r1492为引物 (f27：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3：r1492： 5TACGGCTACCTTGTTACGACTT_3) 。PCR反 应采用25 L体系：l0Buffer 25 gtL、上游引物(10 M)05 u L、下游引物(10 la M)05 1-1 L、dNTP mix(10Mm each)05 1t L、Tap(5u11 L)02 ta L。反应 程序：94预变性5min；9430 S，5535 S，75 1 rain，35个循环；728 min。PCR产物进行制备 形琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收法回收。扩增产物进 行测序，所获得的序列在GenBank中进行BLAST同 源性分析 25回接实验和再分离 取同源性最高的菌株，在TTC平板上28活 化培养，36h后将菌苔刮下，用无菌水配成浓度为 310 CFUml的菌悬液用于接种。盆栽NC89漂浮苗， 成活后用刀伤根，每根灌菌悬液10ml。以自来水为 对照。每菌株接种3株，常规管理。接种后每隔4d 观察症状【 。在烟株表现茎部和下部叶片黑色坏死后， 取样分离病菌，并对分离得到的菌株进行16S rDNA 测序，验证是否为青枯劳尔氏菌。 3结果与分析 31陕西烟田发病概况 根据调查统计结果(表1)，烟草青枯病发生区域 成巨龙等 陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定 89 为陕南汉中、安康和商洛等三个烟区，最高发病率可 达24以上，延安、宝鸡和咸阳等三个烟区尚未发现。 通过系统观察发现，田间烟草青枯病6月上旬开始发 病，7月中旬盛发，时雨时晴的闷热天气病情发展较 快，随温度升高病情加剧。发病30d后，病情有所缓 慢。此外，地势低洼以及有积水的田块，烟草青枯病 发病较重，沿沟渠两岸的沙质土壤上所种植的烟草发 病也较为严重。 表1陕西烟草青枯病田间调查发病率 Tab1 Field survey of the incidence of tobacco bacterial wilt in Shaanxi province 32病原菌的分离及致病性测定 从感病的烟株中分离纯化后得到5个菌株儿1、 儿2、JL3、JL4和JL5。2013年7月23日将分离的 供试菌株JL1、JL2、儿3、儿4和儿5分别接种20 株烟株，经过1520 d后接种烟株均出现典型的青枯 病症状：发病初期烟株叶片萎蔫下垂，随后萎蔫叶片 自下而上变黄、枯死，但是叶片的主脉和侧脉常不变 贰在茎秆基部的外表皮上常伴有明显的黑褐色病斑， 若用刀横切茎基部，剖开表皮，发现维管束变褐且有 污白色菌脓(如图1)。接种JL1菌株的烟株发病率 最高达80。 92 中国烟草学报2014年10月第2O卷第5期 在20102013年全国烟草有害生物第二次调查 时，在陕南3个烟区首次发现烟草青枯病，调查还发 现该病在陕西6月上旬开始发病，7月中旬盛发，时 雨时晴的闷热天气病情发展较快，随温度升高而加剧。 通过对典型病株的病原进行分离、纯化、回接、显微 形态观察、生理生化测定以及16SrDNA序列测定表 明，该细菌属于青枯劳尔氏菌，短杆状，大小为156 228O59091 u，在肉汁培养基上，菌落为圆形， 稍突起，乳白色有光泽，在TTC培养基上，菌落中 央呈粉红色，周围乳白色，流动性强。生理生化特性 研究表明，产酸不产气，可使石蕊牛乳胨化，不能使 明胶液化，不能还原硝酸盐，产氨不产吲哚，能产生 乙酰甲基醇和硫化氢，不能水解淀粉。 将菌悬液接种于健康烟草茎基部，茎均发病，且 致病性较强，说明该致病菌对烟草危害较大，若不及 时防治，将会对烟草造成毁灭性的危害。本文通过对 烟草青枯病在陕西的发生情况、症状、病原鉴定进行 了系统研究，为下一步防治烟草青枯病提供了理论依 据。 3 4】 5】 6 【7】 【8】 9 1O】 参考文献 1 朱贤朝，王彦亭，王智发中国烟草病害北京：中国 12 农业出版社，2002：152162 2 陈瑞泰，朱贤朝，王智发，等全国16个主产烟省(区) 烟草侵染性病害调查报告J中国烟草科学，1997(4)： l一 7 郑继法，丁爱云山东省烟草青枯病的发生和病原菌鉴 定研究J山东农业大学学报，1996，27(1)：17-22 李清飞，李红丽，王岩，等烟草青枯病病原菌的分离 及其拮抗菌的筛选J河南农业科学，2005(1)：51-53 东秀珠，蔡妙英常见细菌鉴定手册M】北京：科学出 版社，2001：349413 Yuan G Q，Xiong Ye Y Fet a1Identification ofpathogen causing Balsam Pear Bacterial wiltJ植物病理学报， 201040(3)：315316 刘勇，秦西云，王敏，等云南省烟草青枯病危害调查 与病原菌分离【JJ中国农学通报，2007，23(4)：311