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Sho rt Comm unica tion 研 究 简 报微 生 物 学 报 A cta M icrobiologica S inica50 (3) : 406 - 410; 4 March 2010ISSN 0001 - 6209; CN 11 - 1995 /Qhttp: / / journals. im. ac. cn /actam icrocn基 金 项 目 :国 家 “ 863计 划 ” (2007AA021503) ;西 北 农 林 科 技 大 学 创 新 团 队 资 助 项 目 (B07049)3 通 信 作 者 。 Tel: + 86229287092434; E2mail: anderong323163. com作 者 简 介 :高 峰 (1983 - ) ,男 ,山 东 日 照 人 ,硕 士 ,研 究 方 向 为 分 子 植 物 病 理 及 植 保 资 源 利 用 。 E2mail: gaofeng007xfg163. com收 稿 日 期 : 2009209222;修 回 日 期 : 2009211210委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接 合 转 移 系 统 的 构 建 及 透 明 颤菌 血 红 蛋 白 的 表 达高 峰 1 ,王 斌 1 ,陈 太 春 1 ,汪 志 军 2 ,安 德 荣 13(1 西 北 农 林 科 技 大 学 植 物 保 护 学 院 ,陕 西 省 农 业 分 子 生 物 学 重 点 实 验 室 ,杨 凌 712100)(2 上 海 交 通 大 学 生 命 科 学 技 术 学 院 ,上 海 200030)摘 要 :【 目 的 】 构 建 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接 合 转 移 系 统 及 透 明 颤 菌 血 红 蛋 白 的 表 达 。 【 方 法 】 以 链 霉菌 广 泛 使 用 的 整 合 型 质 粒 pSET152和 复 制 型 pHZ1358为 出 发 质 粒 ,通 过 供 体 大 肠 杆 菌 ( Escherichia coli)ET12567 (pUZ8002)进 行 属 间 接 合 转 移 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 。 【 结 果 】 确 定 了 该 变 种 的 最 佳 接 合 转 移 条件 ;通 过 SOE2PCR ( Sp licing by overlap extension PCR)技 术 构 建 含 Perm E和 vhb结 构 基 因 融 合 片 段 的 整 合 型表 达 载 体 pJD100,转 化 ET12567 (pUZ8002)后 属 间 接 合 转 移 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 。 通 过 PCR和 CO结合 差 光 谱 验 证 了 vhb基 因 在 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 中 的 整 合 表 达 。 【 结 论 】 本 文 首 次 探 索 了 委 内 瑞 拉 链 霉菌 秦 岭 变 种 接 合 转 移 系 统 ,确 定 了 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 最 佳 接 合 转 移 条 件 ,并 采 用 基 因 工 程 手 段 使vhb基 因 在 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 中 获 得 表 达 。关 键 词 : 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 ; 接 合 转 移 ; vhb基 因 ; CO结 合 差 光 谱中 图 分 类 号 : Q786 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 000126209 (2010) 0320406205瑞 拉 菌 素 ( Zuelaemycin)是 在 进 行 土 壤 拮 抗 微生 物 筛 选 和 利 用 研 究 过 程 中 ,从 秦 岭 太 白 山 区 原 始森 林 土 壤 中 ,分 离 得 到 一 种 编 号 为 S25120的 放 线 菌所 产 生 的 一 种 具 有 自 主 知 识 产 权 的 新 型 微 生 物 农 用抗 生 素 ,通 过 对 该 编 号 为 S25120的 放 线 菌 进 行 生 物特 征 鉴 定 和 生 理 生 化 分 析 ,认 为 S25120是 委 内 瑞 拉链 霉 菌 的 一 个 新 变 种 ,定 名 为 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭变 种 ( S treptom yces venezuelae var. qinlingensis. n.Va r) 1 。 瑞 拉 菌 素 对 水 稻 稻 瘟 病 菌 ( Pyricu lariaoryzae Cav. )、 梨 黑 星 病 菌 ( Fusicladium virescensB on. )、 苹 果 腐 烂 病 菌 ( V alsa m a li M iyabe etYamada. )、 番 茄 灰 霉 病 菌 (B otrytis cinerea Pers. )等多 种 引 起 植 物 病 害 的 病 原 真 菌 具 有 很 强 的 抑 制 作用 1 。 温 室 盆 栽 试 验 还 表 明 ,瑞 拉 菌 素 对 黄 瓜 霜 霉病 菌 ( Pseudoperonospora cubensis (Berk. et Cert. )Rostr. )、 番 茄 早 疫 病 菌 (A lternaria solani ( Ell. etMart) Jones et Grout. )也 具 有 良 好 防 效 2 。委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 发 酵 过 程 是 一 个 严格 的 好 氧 过 程 ,发 酵 过 程 中 菌 丝 体 的 结 构 致 密 性 和发 酵 培 养 基 的 粘 稠 性 ,往 往 使 溶 氧 受 到 限 制 ,严 重 制约 着 抗 生 素 发 酵 效 价 的 提 高 ,严 重 影 响 瑞 拉 菌 素 的规 模 化 生 产 。透 明 颤 菌 血 红 蛋 白 是 一 种 应 用 广 泛 的 原 核 生 物血 红 蛋 白 。 研 究 发 现 VHb蛋 白 具 有 与 氧 接 合 和 传递 氧 的 能 力 ,使 透 明 颤 菌 能 生 存 于 贫 氧 环 境 中 ,基 于这 一 特 性 , vhb基 因 已 在 多 种 异 源 宿 主 ,包 括 细 菌 、酵 母 、 动 植 物 细 胞 中 成 功 表 达 ,它 能 明 显 改 善 异 源 宿主 在 限 氧 条 件 下 的 生 长 ,提 高 宿 主 生 物 量 和 促 进 次级 代 谢 。本 文 是 首 次 探 索 了 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 接高 峰 等 : 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接 合 转 移 系 统 的 构 建 及 透 明 颤 菌 . /微 生 物 学 报 (2010) 50 (3)合 转 移 系 统 ,确 定 了 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 最佳 接 合 转 移 条 件 ,并 采 用 基 因 工 程 手 段 使 vhb基 因在 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 中 获 得 表 达 的 报 道 。1 材 料 和 方 法111 材 料11111 菌 株 和 质 粒 :委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 、 质粒 pUC57,由 本 实 验 室 分 离 和 保 存 ;质 粒 pSET152、pSET152 衍 生 质 粒 p IB139、 pHZ1358、 大 肠 杆 菌DH10B和 ET12567 (pUZ8002)由 上 海 交 通 大 学 生 命科 学 技 术 学 院 邓 子 新 院 士 实 验 室 惠 赠 。11112 主 要 试 剂 和 仪 器 :限 制 性 内 切 酶 、 Taq DNA聚 合 酶 、 T4 DNA L igase、 1kb Ladder均 购 自 大 连TaKaRa公 司 。 硫 链 丝 菌 素 、 安 普 霉 素 、 卡 那 霉 素 、 氯霉 素 、 壮 观 霉 素 和 氨 苄 青 霉 素 购 自 美 国 Sigma2A ldrich Co. ;潮 霉 素 购 自 瑞 士 F. Hottmainn2La RocheL td. ;链 霉 素 和 红 霉 素 购 自 美 国 Am resco Inc. ;地 高辛 杂 交 试 剂 盒 购 自 瑞 士 F. Hottmainn2La RocheL td. 。 PCR仪 购 自 美 国 B io2Rad Laboratories,杂 交 炉购 自 美 国 Thermo Electron Corporation,分 光 光 度 计采 用 美 国 Beckman Coulter的 Beckman DU800。11113 培 养 基 :大 肠 杆 菌 培 养 基 为 LA、 LB;委 内 瑞拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 固 体 培 养 基 为 高 氏 1号 ,液 体培 养 基 为 TSBY;委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 与 大 肠杆 菌 的 接 合 转 移 培 养 基 选 用 了 TSB琼 脂 、 R2YE、 高氏 1号 和 SFM培 养 基 。 LB中 氨 苄 青 霉 素 使 用 量 为100 g/mL, 安 普 霉 素 为 50 g/mL, 氯 霉 素 为25 g/mL;卡 那 霉 素 在 链 霉 菌 中 的 使 用 浓 度 是25 g/mL,在 大 肠 杆 菌 中 是 50 g/mL;接 合 转 移 培养 基 中 安 普 霉 素 使 用 量 为 每 20 m l平 板 1000 g。112 D NA操 作大 肠 杆 菌 质 粒 提 取 、 Southern杂 交 和 DNA探 针的 标 记 参 照 文 献 3 ,链 霉 菌 DNA 提 取 参 照 文 献 4 。113 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 对 抗 生 素 的 敏 感 性检 测参 见 文 献 5 进 行 操 作 。114 大 肠 杆 菌 与 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接合 转 移 体 系 的 构 建委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 孢 子 和 菌 丝 体 的 接 合转 移 参 见 文 献 6 - 8 进 行 操 作 。115 重 组 质 粒 pJD100的 构 建质 粒 pUC57上 含 有 红 霉 素 抗 性 基 因 ( erm E) ,Perm E是 能 在 链 霉 菌 中 组 成 型 表 达 且 较 强 的 启 动子 。 根 据 GenBank上 公 布 的 vhb基 因 和 erm E序列 ,设 计 引 物 GP1、 GP2、 GP3、 GP4,均 由 上 海 生 工 合成 ,在 GP1和 GP4引 物 的 5端 引 入 EcoR 和 N de位 点 (下 划 线 部 分 )。 引 物 序 列 如 表 1所 示 :表 1 基 因 扩 增 引 物 序 列Table 1 Primer used in competence and sporulation associated genes PCRPrimer Sequence (5 3 ) Size /bp Restriction siteGP1 CGGAA TTA GGTACCAGCCCGACCCGAGCAC 30 EcoRGP2 TGGTTTGCTGGTCTAACATGCGCTGGATCCTACCA 35GP3 TGGTAGGATCCAGCGCATGTTAGACCAGCAAACCA 35GP4 GGGAATTCCATATGTTATTCAACCGCTTGAGCGT 34 N de2 结 果211 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 对 抗 生 素 的 敏 感 性为 了 确 定 用 于 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 进 行 遗传 操 作 的 选 择 标 记 ,检 测 了 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变种 对 安 普 霉 素 、 卡 那 霉 素 、 硫 链 丝 菌 素 、 壮 观 霉 素 、 氯霉 素 、 潮 霉 素 、 链 霉 素 、 红 霉 素 和 氨 苄 青 霉 素 9种 抗生 素 的 抗 性 水 平 。 结 果 如 表 2所 示 ,委 内 瑞 拉 链 霉菌 秦 岭 变 种 对 硫 链 丝 菌 素 特 别 敏 感 ,在 浓 度 大 于 等于 011 g/mL的 平 板 上 就 不 生 长 ;对 安 普 霉 素 、 链霉 素 、 红 霉 素 比 较 敏 感 ,在 浓 度 为 110 g/mL板 上生 长 缓 慢 ,在 浓 度 大 于 等 于 210 g/mL的 平 板 上 不生 长 ;对 卡 那 霉 素 、 壮 观 霉 素 、 氯 霉 素 在 浓 度 为210 g/mL的 平 板 上 生 长 缓 慢 ;对 潮 霉 素 在 浓 度 为1010 g/mL 的 平 板 上 生 长 缓 慢 , 但 在 浓 度 为5010 g/mL的 氨 苄 青 霉 素 平 板 上 仍 能 正 常 生 长 。本 实 验 结 果 表 明 硫 链 丝 菌 素 、 安 普 霉 素 、 链 霉 素 、 红霉 素 、 壮 观 霉 素 、 氯 霉 素 和 卡 那 霉 素 可 以 作 为 委 内 瑞拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 进 行 遗 传 操 作 的 选 择 标 记 。704Feng Gao et al. /A cta M icrobiologica S inica (2010) 50 (3)表 2 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 对 抗 生 素 的 敏 感 性Table 2 Antibiotic Sensitivity of S treptom yces venezuelae var. Q inlingensisAntibiotics Antibiotics concentration in MM medium / ( g/mL)0 011 015 110 210 510 1010 5010Thiostrep ton + + - - - - - - -Ap ramycin + + + + + + / - - - - -Strep tomycin + + + + + + / - - - - -Erythromycin + + + + + / - + / - - - - -Spectinomycin + + + + / - + / - + / - - - -Chloramphenicol + + + + + + + / - + / - - - -Kanamycin + + + + + + + / - + / - - - -Hygromycin + + + + + + + + + / - + / - -Amp icillin + + + + + + + + + + + + + + + : Normal growth; + : Slow growth; + / - : L ight growth; - : No growth.212 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 接 合 转 移 系 统 的建 立 和 优 化分 别 以 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 孢 子 和 菌 丝体 做 为 受 体 ,选 用 了 TSB琼 脂 、 R2YE、 高 氏 1号 和SFM培 养 基 进 行 接 合 转 移 。 结 果 表 明 ,以 菌 丝 体 为受 体 的 接 合 转 移 实 验 中 ,在 任 何 培 养 基 上 均 未 得 到的 接 合 子 ;而 孢 子 在 高 氏 1号 培 养 基 上 长 出 了 上 百个 接 合 子 ,在 其 他 培 养 基 上 不 生 长 或 仅 长 出 零 星 几个 。 因 此 高 氏 1号 培 养 基 是 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变种 接 合 转 移 的 首 选 培 养 基 。实 验 发 现 热 激 温 度 对 孢 子 萌 发 的 影 响 如 图 1所示 , 45 处 理 20 m in时 ,热 激 孢 子 的 萌 发 率 最 高 ,显著 高 于 没 有 热 激 孢 子 的 萌 发 率 (未 热 激 的 孢 子 活 力定 为 100% ) ,因 此 确 定 了 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种孢 子 在 45 时 处 理 20 m in的 热 激 条 件 作 为 接 合 转移 的 最 佳 条 件 ,可 用 于 后 继 实 验 。图 1 不 同 热 激 温 度 对 包 子 萌 发 的 影 响Fig. 1 Influence of heat treatment on spore germ ination.实 验 还 发 现 抗 生 素 覆 盖 时 间 对 接 合 转 移 效 率 影响 明 显 ,在 本 实 验 条 件 下 , 11 h覆 盖 效 果 最 佳 。 时间 少 于 11 h,孢 子 萌 发 后 还 没 有 充 分 表 达 转 移 进 去的 抗 生 素 ,覆 盖 将 杀 死 菌 体 ;时 间 超 过 11 h,菌 丝 体生 长 过 旺 ,没 有 转 进 质 粒 的 菌 体 也 将 生 长 ,不 利 于 后期 的 阳 性 克 隆 的 筛 选 。在 同 样 条 件 下 ,高 拷 贝 载 体 pHZ1358的 接 合 转移 效 率 低 于 整 合 型 载 体 pSET152, 可 能 是 因 为pHZ1358 是 高 不 稳 定 sti+ 载 体 的 缘 故 。 而 且pHZ1358的 链 霉 菌 复 制 子 是 不 稳 定 的 ,在 没 有 抗 生素 选 择 下 很 容 易 丢 失 。表 3 不 同 质 粒 的 接 合 转 移 效 率Table 3 Effects of different donors plasmids on conjugal transferDonor1 Plasm id Recep torspores2 Conjugants Efficiency ofconjugal transfer3ET12567(pUZ8002)pSET152pHZ1358107108236932136 10 - 5913 10 - 711The quantity of donor E. coli in every experimental was ca. 108 /mL;21Conjugants were counted from Gause s Synthetic Agar p lates;31Conjugation efficiency was exp ressed by the number of conjugant/recep tor. Data were obtained from three experimental repeats.实 验 确 定 ,以 pSET152为 出 发 质 粒 ,委 内 瑞 拉链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接 合 转 移 的 优 化 体 系 为 :选 取供 体 菌 /受 体 孢 子 为 108 107 ,孢 子 的 热 激 温 度 为45 时 处 理 20 m in,在 30 培 养 11 h进 行 覆 盖 ,吹干 后 继 续 培 养 72 h后 可 见 接 合 子 长 出 。213 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 转 化 子 的 Southern杂 交 检 测 和 分 析根 据 质 粒 pSET152的 酶 切 位 点 ,用 限 制 性 内 切酶 H ind 和 X ho 完 全 酶 切 ,回 收 酶 切 位 点 之 间 含有 C31 attP位 点 的 约 213 kb的 片 段 作 为 探 针 ,与接 合 子 总 DNA经 B am H 酶 切 的 片 段 杂 交 。 杂 交结 果 显 示 (图 2) ,在 随 机 提 取 的 4个 接 合 子 样 品 的DNA中 都 出 现 了 两 条 杂 交 信 号 。 而 以 委 内 瑞 拉 链霉 菌 秦 岭 变 种 总 DNA经 B am H 酶 切 后 的 样 品 作为 对 照 ,在 同 样 的 条 件 下 杂 交 显 示 阴 性 。 结 果 表 明质 粒 pSET152能 以 attP位 点 整 合 到 委 内 瑞 拉 链 霉菌 秦 岭 变 种 的 染 色 体 上 ,说 明 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭变 种 具 有 其 对 应 的 attB位 点 ,可 作 为 整 合 型 载 体 的衍 生 质 粒 的 遗 传 操 作 对 象 。804高 峰 等 : 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接 合 转 移 系 统 的 构 建 及 透 明 颤 菌 . /微 生 物 学 报 (2010) 50 (3)图 3 工 程 菌 株 细 胞 粗 提 物 的 CO差 光 谱Fig. 3 Carbon monoxide binding difference spectrum of crude cell extract from engineering strainof S treptom yces venezuelae var. Q inlingensis.图 2 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 转 化 子 的 Southern杂 交检 测Fig. 2 Soutern blotting confirmation of pSET152 integrated intoS treptom yces venezuelae var. Q inlingensis chromosome. A: Agarosegel of S treptom yces venezuelae var. Q inlingensis conjugantschromosome DNA digested with B am H . B: Southern blotted gel ofA. Integrated pSET152 was p robed with C31 attP containing 2.3kb DNA of pSET152 fragment labeled by dUTP2digoxin. M: markerDNA; Lane 1 to 4: S treptom yces venezuelae var. Q inlingensis pSET152conjugants; P: pSET152 digested with H ind and Xho ; CK:chromosome DNA of S treptom yces venezuelae var. Q inlingensisdigested with B am H as a negative control.214 整 合 型 载 体 pJD100的 构 建质 粒 pUC57上 含 有 红 霉 素 抗 性 基 因 ( erm E) ,Perm E是 能 在 链 霉 菌 中 组 成 型 表 达 且 较 强 的 启 动子 。 根 据 GenBank上 公 布 的 vhb基 因 和 erm E序列 ,利 用 引 物 GP1、 GP2 为 引 物 扩 增 出 280 bp左 右的 Perm E;利 用 引 物 GP3、 GP4为 引 物 扩 增 出 460 bp左 右 的 vhb基 因 ;利 用 SOE2PCR将 vhb基 因 置 于 的Perm E启 动 子 之 下 ,利 用 Perm E启 动 子 表 达 vhb基因 。 将 Perm E + vhb 克 隆 到 pSET152 衍 生 质 粒p IB139上 ,利 用 蓝 白 斑 筛 选 得 到 克 隆 子 pJD100,酶切 分 析 Perm E + vhb已 成 功 克 隆 到 载 体 上 ,并 以 相同 的 方 法 构 建 不 含 vhb的 载 体 pJD101作 为 对 照 。215 vhb基 因 在 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 中 的 整合 表 达重 组 质 粒 pJD100含 有 attP整 合 位 点 ,可 特 异性 的 整 合 到 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 的 染 色 体 上 ,PCR验 证 vhb基 因 已 成 功 整 合 到 染 色 体 上 ,并 将 工程 菌 株 在 无 抗 生 素 压 力 的 情 况 下 ,续 传 10代 后 提 取DNA,以 此 为 模 板 PCR验 证 表 明 vhb基 因 仍 稳 定 整合 在 染 色 体 上 。 CO结 合 差 光 谱 检 测 工 程 菌 株 细 胞粗 提 物 ,发 现 在 420 nm 处 有 一 个 特 征 吸 收 峰 (图3) ,表 明 vhb基 因 已 成 功 的 表 达 出 具 有 生 物 活 性 的VHb蛋 白 。3 讨 论接 合 转 移 作 为 一 种 基 因 转 移 手 段 已 在 多 种 链 霉菌 中 成 功 应 用 ,它 不 仅 可 以 避 开 胞 外 核 酸 酶 ,使DNA免 遭 核 酸 酶 的 降 解 ,在 某 种 程 度 上 克 服 宿 主 对外 源 DNA的 限 制 性 障 碍 ;而 且 操 作 程 序 相 对 简 单 ,是 一 种 很 有 潜 力 的 基 因 转 移 方 法 9 。目 前 ,国 内 外 大 肠 杆 菌 和 委 内 瑞 拉 链 霉 菌 属 间接 合 转 移 系 统 并 没 有 明 确 的 报 道 ,委 内 瑞 拉 链 霉 菌秦 岭 变 种 作 为 一 种 新 型 链 霉 菌 ,本 实 验 首 次 探 索 并904Feng Gao et al. /A cta M icrobiologica S inica (2010) 50 (3)优 化 了 大 肠 杆 菌 /委 内 瑞 拉 链 霉 菌 秦 岭 变 种 属 间 接合 转 移 系 统 ,优 化 了 接 合 转 移 条 件 。本 实 验 由 于 vhb基 因 自 身 携 带 的 启 动 子 在 链 霉菌 中 无 法 识 别 ,所 以 试 验 中 选 择 在 链 霉 菌 中 可 表 达的 强 启 动 子 erm E,利 用 整 合 型 载 体 将 vhb基 因 整 合到 链 霉 菌 的 染 色 体 上 ,以 期 通 过 改 善 工 程 菌 株 的 对氧 的 利 用 率 ,对 链 霉 菌 次 级 代 谢 进 行 正 向 调 控 。 本实 验 实 现 了 外 源 基 因 定 植 于 产 瑞 拉 菌 素 抗 生 素 的 工程 菌 株 中 ,并 得 了 稳 定 表 达 ,但 要 实 现 瑞 拉 菌 素 的 大规 模 工 业 化 生 产 还 需 要 进 一 步 的 实 验 研 究 。抗 生 素 是 我 国 最 大 的 生 物 产 业 ,但 vhb基 因 要在 发 酵 工 业 上 真 正 应 用 还 需 要 不 断 的 改 造 。 随 着 链霉 菌 基 因 工 程 技 术 的 发 展 ,使 得 克 隆 次 级 代 谢 产 物的 合 成 基 因 、 有 目 的 的 定 向 改 造 基 因 、 提 高 基 因 表 达水 平 以 改 造 菌 株 的 生 产 能 力 、 基 因 重 组 产 生 新 化 合物 等 多 种 改 造 成 为 可 能 。瑞 拉 菌 素 作 为 一 种 新 型 的 抗 生 素 ,以 期 通 过 基因 重 组 获 得 高 效 价 的 工 程 菌 株 ,实 现 瑞 拉 菌 素 的 大规 模 工 业 化 生 产 ,对 提 高 我 国 抗 生 素 在 国 际 市 场 上的 竞 争 力 ,研 发 具 有 独 立 知 识 产 权 的 新 型 农 药 等 具有 重 要 意 义 ;对 保 护 生 态 环 境 、 发 展 绿 色 农 业 也 具 有一 定 的 积 极 作 用 。参 考 文 献 1 安 德 荣 ,幕 小 倩 . 瑞 拉 菌 素 产 生 菌 的 鉴 定 . 微 生 物 学杂 志 (Journal of M icrobiology) , 2002, 22 (2) : 526. 2 疏 秀 林 ,安 德 荣 . 瑞 拉 菌 素 产 生 菌 S25120菌 株 防 治 黄瓜 霜 霉 病 害 的 研 究 初 报 . 西 北 植 物 学 报 ( A ctaB otanica B oreali2O ccidentalia S inica ) , 2004, 24 ( 11 ) :211822122. 3 Sambrook J, Fritsh E, Maniatis T. Molecular Cloning:ALaboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Sp ringHarbor Laboratory Press, 2002. 4 Pwood DA, B ihb MJ, Chater KF. 链 霉 菌 遗 传 操 作 实 验手 册 . 邓 子 新 ,唐 纪 良 译 . 第 一 版 . 长 沙 :湖 南 科 学 技术 出 版 杜 , 1988. 5 Kieser T, B ibb MJ, Chater KF, et al. Practicalstrep

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