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文档简介

土 塑 化 学 与 生 物 物 理 进 展 夕 年 第 卷 第 期固 相 分 子 杂 交 技 术 在 植 物 病 毒 鉴 定 和 分 类 研 究 中 的 应 用安 德 荣 魏 宁 生西 北 农 业 大 学 植 保 系 , 陕 西 杨 隆 联 邦 德 国 生 物 研 究 中 心提 要在 用 斑 点 杂 交 试 验 时 属 于 个 病 毒 组 的 个 不 同 病 毒 进 行 鉴 定 和 分 类 研 完中 观 察 到 , 杂 交 现 象 不 仅 出 现 在 同 源 病 毒 之 间 , 也 同 样 出 现 在 相 同 病 毒 组 或 不 同 病毒 组 的 异 源 病 毒 之 间 。 定 量 的 斑 点 杂 交 试 验 时 仅 有 轻 微 血 清 学 区 别 的 病 毒 很 敏 惑 。在 避 免 竟 争 和 饱 和 现 象 村 实 验 结 果 影 响 的 情 况 下 , 检 测 了 番 茄 丛 矮 病 毒 组 五 个 病 毒的 之 间 的 同 源 性 程 度 , 结 果 表 明 , 这 五 种 病 毒 之 间 的 同 源 性 程 度 与和 。 所 做 的 血 清 学 结 果 相 近 。前 宫近 几 年 , 核 酸 分 子 杂 交 技 术 日 趋 完 善 , 以 不同 材 料 为 支 持 物 的 固 相 分 子 杂 交 技 术 取 得 了 更为 迅 速 的 发 展 “ , 。 斑 点 杂 交和 吸 印 杂 交技 术 都 属 于 将 病 毒 的核 酸 固 定 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上 , 用 牛 标 记 的 互补 一 做 探 针 的 固 相 杂 交 技 术 。这 一 技 术 显 示 了 对 植 物 病 毒 进 行 鉴 定 和 分 类 研究 的 潜 在 能 力 田 。 在 通 过 用 反 转 录 酶 合 成 的。 对 属 于 个 病 毒 组 的 科 个 不 同 病 毒 进行 研 究 中 , 观 察 到 一 些 实 验 参 数 对 结 果 有 影响 。 本 文 也 报 道 了 用 血 清 学 技 术 尚 不 能 鉴 别 的一 、 一 及 、 可以 用 斑 点 杂 交 技 术 进 行 鉴 别 。 有 关 番 茄 丛 矮 病毒 组 分 类 问 题 的 讨 论 由 来 已 久 , 而 且 至 今 尚 未结 束 。 虽 然 通 过 血 清 学 方 法 可 以 将 各 个 成 员 区别 开 来 , 但 它 们 之 间 的 血 清 学 关 系 却 很 复 杂 , 各个 病 毒 之 间 的 亲 缘 关 系 尚 不 清 楚 。 本 文 也 报 道了 用 斑 点 杂 交 技 术 对 番 茄 丛 矮 病 组 的 五 个 病 毒只 之 间 的 同 源 性 程 度 的 研 究 结 果 。材 料 和 方 法病 毒 的 种 类 和 硝 酸 纤 维 素 膜 斑 点 的 制 备下 列 病 毒 的 提 纯 物 均 由 联 邦 德 国 生 物 研 究中 心 病 毒 所 提 供 。芜 著 黄 色 花 叶 病 毒 组 。安 第 期 马 铃 薯 潜 病 毒 的 株 系, 、 株 系 一 , , 和株 系 一 , 颠 茄 斑 驳 病 毒 , 山 马 蝗 植 物 黄 斑 病 毒 , , 可可 黄 花 叶 病 毒 , , 糖 芥 属 植 物 潜病 毒 , , 茄 花 叶 病 毒 , ,肯 尼 迪 黄 花 叶 病 毒 , , 花 叶病 毒 , , 花 叶 病 毒, , 玄 参 属 斑 驳 病 毒 的 典 型 标 本 株 系和 株 系 一 , 。, , 芜 着 黄 色 花 叶 病 毒 ,和 野 黄 瓜 花 叶 病 毒 , 。番 茄 丛 矮 病 毒 组菊 芋 斑 皱 病 毒 , , 荷 兰 石 竹 意 大表 示 该 病 毒 在 图 、 中 的 排 列 位 置 , 以 下 均 类 。利 环 斑 病 毒 , , 建 兰 属 植 物 环 斑 病毒 , , 摩 洛 哥 辣 椒 病 毒 ,钓 , 矮 牵 牛 星 状 花 叶 病 毒 , , 天竺 属 植 物 叶 卷 病 毒 , , 番 茄 丛 矮 病毒 的 典 型 株 系 和 株 系 一 , 。一 , 。 , ,石 竹 斑 驳 病 毒 组 石竹 斑 驳 病 毒 , , 黄 瓜 土 传 病 毒, , 天 竺 花 碎 病 毒 , 和芜 着 皱 叶 病 毒 , 。荷 兰 石 竹 环 斑 病 毒 组荷 兰 石 竹 环 斑 病 毒 , 。弧 豆 花 叶 病 毒 组 安第 期 马 铃 薯 斑 驳 病 毒 , 。雀 麦 花 叶 病 毒 组 雀 麦花 叶 病 毒 , 。烟 草 花 叶 病 毒 组 了 河流 烟 草 花 叶 病 毒 , 。 待发 表 , 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 , , ,花 叶 病 毒 , , 齿 兰 环 斑 病毒 丫 , , 辣 椒 轻 花 叶 病 毒 ,乃 , 电 河 流 烟 草 花 呼 肩 毒 , ,待 发 表 , 烟 草 花 叶 病 毒 ,烟 草 退 绿 斑 驳 病 毒 幼 , 力 幻 和 烟 草 花 叶病 毒 ,甜 菜 坏 死 黄 脉 病 毒 组甜 集 坏 死 黄 脉 病 毒 如 , 和 分离 物 一 , , 未 鉴 定 。马 铃 薯 病 毒 组 , 马铃 薯 病 毒 , 和 仙 人 掌 属 病 毒六 , 。 荷 兰 石 竹 潜 病 毒 菊属 植 物 病 毒 , 。将 上 述 各 病 毒 的 提 纯 物 拼 幻 点 样 到 预先 角 溶 液 标 准 柠 檬 酸 盐 水 处 理 过的 硝 酸 纤 维 素 膜 上 , 在 。 下 真 空 千 燥 两 小时 。么 核 酸 的 制 备 、 电 泳 分 离 和 吸 印 转 移将 提 纯 的 、 一 、 一 、 、 、 、 、 、 、 、 、和 的 各 个 病 毒 粒 子 制 剂 , 分别 用 两 相 酚 一 法 抽 提 病 毒 核 酸 。 病 毒 核 酸 的进 一 步 纯 化 采 用 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 , , 收 集 带 , 加 二 倍 冰 冷 乙 醇沉 淀 , 沉 淀 悬 浮 在 蒸 馏 水 中 备 用 。 将 各提 纯 的 一 、 、 、 、 、 和 的 病 毒群 在 含 多 甲 酸 胺 的 必 琼 脂糖 凝 胶 中 进 行 电 泳 , 电 泳 缓 冲 液 为一 醋 酸 及 醋 酸 钠 溶 液 , ,电 泳 条 件 为 。 使 各 个 病 毒 的 多组 分 核 酸 分 离 开 来 。 电 泳 后 , 凝 胶 上 的 各带 在 溶 液 介 质 中 通 过 滤 纸 吸 附 转 移到 预 先 用 处 理 后 的 硝 酸 纤 维 素 膜上 , 吸 印 过 夜 , 取 出 硝 酸 纤 维 素 膜 , 真 空干 燥 小 时 。 标 记 的 制 备反 转 录 酶 法 制 备 一 按 照 的 方 法 分 别 制 备 、 一 、启 、 、 、 、 广 和病 毒 姨 的 。 。 取 咫 做为 模 板 的 各 样 品 和 试 剂 按 以 下 顺 序 分 别加 入 灭 菌 的 夕 离 心 管 内 弓 川 随 饥 引 物 、邵 随 机 引 物 缓 冲 液 。 助 、 价 、, 、 那 酶 抑 制 剂 个 单位 , 产 反 应 底 物 勿 、 、和 、 产 一 一川 , 最 后 加 入 。 川 禽 类 白 血 病 毒 反转 录 酶 , 在 下 保 温 分 钟 , 加 川终 止 反 应 并 水 解 模 板 , 保温 分 钟 , 然 后 加 人 相 应 的 使 反 应 液 呈中 性 , 用 乡 柱 收 集 标 记 的缺 口 翻 译 制 备克 隆 化 的 取 拌 含 有 克 隆 化一 的 细 菌 质 粒 , 加 人 件的 、 、 户 , 声一 及 风 聚 合 酶 和 酶混 合 物 , 总 体 积 为 川 。 在 水 浴 一 户 保 温夕 分 钟 , 然 后 加 川 反 应 终 止 缓 冲 液 终 止 反应 用 柱 收 集 标 记 的斑 点 杂 交 和 吸 印 杂 交为 了 减 少 在 膜 上 非 杂 交 性 吸 附 ,杂 交 前 , 将 上 述 各 处 理 后 的 硝 酸 纤 维 素 膜 放 人含 有 多 甲 酸 胺 、 、 肠 、 并、 肠 聚 乙 烯 毗 咯 烷 酮 、缓 冲 液 及 产 变 性 娃鱼 精 子 的 预 杂 交 缓 冲 液 中 进 行 预 杂 交之 、 保 温 小 时 。 分 别 在 预 杂 交 缓 冲 液 中加 人 体 积 的 各 个 变 性 的 一 组 成杂 交 缓 冲 液 , 和 相 应 预 杂 交 后 的 膜 进 行分 子 杂 交 , 保 温 小 时 。杂 交 后 的 漂 洗 和 检 测 分 别 用 含 有 多 的 和 伙缓 冲 液 在 室 温 下 将 膜 漂 洗 分 钟 及 在。 下 漂 洗 分 钟 。 将 膜 烘 干 、 分钟 , 用 放 射 性 自 显 影 法 和 液 闪 计 数 器 检 测 。结 果。 定 性 检 测为 了 探 明 山 斑 点 杂 交 技 术 能 否 用 来对 病 毒 进 行 鉴 定 和 分 类 研 究 , 和 进 一 步 研 究 一些 新 近 发 现 的 病 毒 特 点 , 我 们 将 提 纯 的 属 于个 病 毒 组 的 个 不 同 病 毒 进 行 不 同 的杂 交 试 验 。 结 果 如 图 、 所 示 , 无 论 是 用 克 隆图 图 和 一 图 的 卜 和 个 不 同 病 易 的 斑 点 杂 交 结 果和 一 釜 在 图 、 中 的 位 置 分 只 早 、朴 刀 拜 召 积 姗 凌 气 次 七 歌 卜 冲 矽 树 版 冲 袋 价 教 沙 孔 赶 份 阳 杀 田 塞 狱 犷 千 蔑 努 毛 任 抢 丫 价 必图 克 隆 化 的 丫 的己 和 “ 个 不 同 脚 套 的 斑 点 杂 交 结 果图 。 、 分 别 表 示 杂 交 后 的 漂 洗 温 度 为 、 图 表 示 在 缺 少 甲 酞 胺 的 杂 交 级 冲 液 中 的 杂 交 结 果 二 二 二 二 一 一 口 扣 且 田二叫一胃抓 德甘,二,协吕七翻照袱簇卜卜国咬势刀卜卜闷山代卜且卜曰代化 的 一 的 还 是 用 没 有 克屯 隆 化 的 一 、 和 丫 一的 进 行 杂 交 , 除 可 看 到 和 同 源性 病 毒 之 间 有 明 显 的 杂 交 反 应 外 , 还 可 看 到 和其 它 病 毒 包 括 相 同 病 毒 组 内 或 不 同 病 毒 组 内也 有 杂 交 现 象 。 当 我 们 将 杂 交 后 的 漂 洗 温 度 提高 至 时 图 或 在 缺 少 多 甲 酞 胺 的杂 交 缓 冲 液 的 情 况 下 , 将 杂 交 温 度 提 高 到 时 , 异 源 性 的 杂 交 反 应 变 微 弱 , 但 不 能 完 全 消除 。 在 用 核 酸 酶 处 理 膜 或 在 杂 交 缓 冲 液 中加 人 肝 素 的 条 件 下 , 也 可 使 异 源 性 杂 交 反 应 变肩 习 。闷 耳 曰山 山咬 叫圈 用 斑 点 杂 交 试 驻 对 血 清 学 技 术 尚 不 能 鉴 定 的人 一 、 一 。 和 、 的鉴 别 结 果切 的 一 卜 有 杂 交 现 象 , 而 和 其 它组 病 毒 的 之 间 没 有 杂 交 现 象 。诩 一 的 。 和 一 。 、 、 、 、 、 、 的 吸 印 杂 交 结 果图 、 表 示 杂 交 后 的 漂 洗 温 度 分 别 为 允 、 , 。在 吸 印 杂 交 中 , 用 以 一 的为 膜 板 反 转 录 合 成 的 , 来 测 定和 一 。 。 及 其 它 组 病 毒 、 、 、 的之 间 同 源 性 关 系 。 当 杂 交 后 的 漂 洗 温 度 为 时 , 也 出 现 异 源 杂 交 现 象 图 。 。 但 将 漂 洗 温度 提 高 至 时 , 仅 和 血 清 学 关 系 密图 斑 点 杂 交 中 的 竟 争 现 象之 定 皿 检 测用 标 记 的 。 进 行 定 量 的 斑 点 杂交 试 验 , 用 液 闪 计 数 器 测 定 结 果 , 可 以 用 来区 分 血 清 学 关 系 很 密 切 的 病 毒 。 用 血 清 学 技术 尚 不 能 鉴 别 的 一 和 一 、和 , 采 用 宁 量 的 斑 点 杂 交 技 术都 可 进 行 明 显 的 区 分 图 呼 。用 有 明 显 的 血 清 学 区 别 的 病 毒进 行 杂 交 比 较 试 验 , 观 察 到 测 定 的同 源 性 结 果 受 以 下 几 个 参 数 的 影 响 。竟 争 现 象 在 有 一 定 量 , 每 块膜 的 条 件 下 , 同 源 和 异 源在 杂 交 反 应 中 存 在 有 竟 争 现 象 图 。 图表 示 每 个 斑 点 的 含 量 从 开 始 稀 释至 , 图 表 示 每 个 斑 点 的 含 量 从石 开 始 稀 释 至 , 两 块 硝 酸 纤 维 素 膜 中均 加 人 等 量 的 一 的 。 。 图 ,中 , 同 源 , 特 别 是 高 浓 度 斑 点 对、 有 强 烈 的 杂 交 吸 附 作 用 , 使 溶 液 中。 量 明 显 减 少 , 因 此 探 针 仅 能 检一 一硝 酸 纤 维 素 膜 小 块 上 浓 度图 斑 点 杂 交 中 的 饱 和 效 应 , 口 , 和 表示 不 同 浓 度 下 和 之 间 的 同 源性 百 分 比测 出 高 浓 度 、 、 斗 的 同 源 和 异 源。 在 图 中 , 竞 争 现 象 明 显 减 少 , 在 低 浓度 下 、 、 、 同 源 和 异 源都 可 被 检 测 出 来 。 饱 和 效 应 为 了 避免 竟 争 现 象 , 将 每 个 浓 度 点 样 到 分 离 的硝 酸 纤 维 膜 小 块 上 。 勺 , 每 个 小 块 加 人 等 量的 , 在 分 离 的 小 容 器 中 进 行 杂 交 反 应 ,结 果 如 图 所 示 。 在 这 一 条 件 下 , 硝 酸 纤 维 素膜 小 块 上 的 同 源 或 异 源 不 会 因 为 对有 明 显 的 杂 交 吸 附 作 用 而 影 响 相 邻 斑 点 的 低 浓度 杂 交 反 应 。 但 如 果 硝 酸 纤 维 素 膜 小块 上 有 过 高 的 浓 度 , 则 会 出 现 饱 和 现 象 ,即 在 高 浓 度 下 , 同 源 和 异 源 都 有较 强 的 杂 交 反 应 。 如 图 所 示 , 为 了 避 免的 饱 和 现 象 , 对 不 同 浓 度 的 进 行 一 系 列杂 交 试 验 , 证 明 在 的 浓 度 下 , 可 以进 行 定 量 斑 点 杂 交 试 验 。在 避 免 上 述 参 数 的 影 响 下 , 用 定 量 斑点 杂 交 试 验 检 测 了 番 茄 丛 矮 病 毒 组 五 个 病 毒之

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