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文档简介
, 一 年 掀 生 物 学 通 报沪 理 , 月 魂 , 召 嘴扫 究 报 告 用 互 补 分 子 杂 交 技 术 研 究 番 茄 丛 矮冬 魂 心 召 召 召 心 城 病 毒 组 病 毒 序 列 的 同 源 性安 德 采 慕 小 清西 北 农 业 大 学 植 保 系 , 肤 八 汤 陵摘 要 分 别 以 一 、 一 、 一 、 一 和 一和 每 个 同 源 或 异 源 的 进 行 斑 点 杂 交 , 研 究 番 茄 从 矮 病 毒 组 病 毒和 略 肠 及 帕 、 和 ,肠 及有 较 大 的 序 列 同 源 性 , 一 和 每 个 病 毒 之 间 的 同 源 性 低 。关 键 词 分 子 杂 交 植 物 病 毒 番 茄 丛 屡 病 毒 组为 模 板 反 转 录 合 成 的序 列 的 同 源 性 。 结 果 表 明 ,峪 之 司 的有 关 番 茄 丛 矮 病 毒 组 分类 问 题 的 讨 论 由 来 已 久 【 , 而 且 至 今 尚 未 结 束 在 植 物 病 毒 描 述 中 刘 , 番 茄 丛 矮 病 毒 。做 为 这 一 组 典 型成 员 , 而 将 菊 芋 斑 皱 病 毒 。、 荷 兰 石 竹 意 大 利 环斑 病 毒 、 天 竺 属 植 物 叶 卷 病 毒和 矮 牵 牛 星 状 花 叶病 毒做 为 的 株 系 。 但 在 第 四 届 国 际 病 毒 分类 委 员 会 报 告 中 , 根 据 病 毒 粒 子 为 球 状 二 十 四面 体 及 单 链 特 点 , 认 为 番 茄 丛 矮 病 毒 组 包括 以 下 个 确 定 成 员 、 、 、 、 茄 斑 皱 病 毒一 一 和 剑 兰 属 植 物环 斑 病 毒 。 虽 然 通 过 血 清 学 方 法 可 以 将 各 个 成员 区 别 开 来 , 但 它 们 之 间 的 血 清 学 关 系 却 很 复杂 , 亲 缘 关 系 变 化 也 很 大 , 仅 和有 血 清 学 关 系 , 其 它 各 病 毒 间 的 亲 缘 关 系 尚 不清 楚 。 本 文 用 分 子 杂 交 技 术 一 一 斑 点杂 交 法 研 究 、 、 、 冉 和相 互 之 间 人 序 列 同 源 性 , 并 对 它 们 进 行 亲缘 性 程 度 顺 序 的 排 列 , 和 血 清 学 测 定 结 果 进 行比 较 分 析 。一材 料 和 方 法病 毒 的 提 纯、 、 、和 分 别 在 , 。 。 烟草 上 繁 殖 , 接 种 后 一 天 收 集 发 病 叶 片 , 并 立即 在 含 有 外 抗 坏 血 酸 的 醋 酸 盐缓 冲 液 中 匀 浆 , 用 醋 酸 调 节 困 到, 使 滤 液 澄 清 , 低 速 离 心 , 分钟 , 用 调 上 清 液 到 , 用 聚 乙 二醇 和 醋 酸 盐 缓 冲 液。 病 毒 拉 子 进 一 步 提 纯 采 用 密度 梯 度 离 心 , , 小时 , 用 注 射 针 头 收 集 病 毒 拉 子 带 , 用溶 液 透 析 除 去 。二 的 制 备将 所 得 病 毒 用 两 相 酚 一 法 抽 提 病 毒 核酸 , 的 进 一 步 纯 化 采 用 蔗 糖 密 度 梯 度 离心 小 时 。 收 集 带 , 加 二倍 乙 醇 沉 淀 , 沉 淀 悬 浮 在 无 菌 蒸 馏 水 中 。三 ” 一 的 制 备按 照 。 , 的 方 法 , 分 别 制 备 、 、 、 和各 基 因 的 互 补 。 将 。 雌 的 各样 品 和 试 剂 , 按 以 下 顺 序 分 别 加 人 灭 菌 的管 内 随 机 引 物 牛 胸 腺加 的 , 在 下 裂 解, ” 。 徽 生 物小 时 、 产 随 机 引 物 缓 冲 液卜 、 、, 、 产 酶 抑 制 剂个 单 位 、 产 反 应 底 物、 、 和 、拼 一 ” 一 产 , 最 后 加 人 拼个 单 位 禽 类 白 血 病 毒 反 转 录 酶 , 混合 均 匀 后 , 在 水 浴 中 保 温 分 钟 , 然 后 加人 产 , 在 保 温 分 钟 , 终止 反 应 并 水 解 模 板 , 加 知中 和 前 面 加 人 的 , 使 反 应 液 呈 中 性 。 用预 先 平 衡 过 的 柱 收 集平 衡 液 为 一 , 。 , , 用 上述 平 衡 液 洗 脱 次 每 次 川 , 收 集 每 次 洗脱 液 , 并 用 液 体 闪 烁 计 数 器 测 放 射 性 强 度, 收 集 含 有 标 记 样 品 的 第 一 个放 射 峰 。四 斑 点 制 备 和 斑 点 预 杂 交将 各 个 样 品 川 用 微 量 点 样器 点 到 预 先 用 平 衡 过 的 硝 酸 纤 维 膜上 , 每 次 点 样 为 川 , 斑 点 大 小 为 左右 , 点 样 后 将 膜 在 真 空 千 燥 小 时 , 然 后将 膜 放 人 含 有 外 氏 、 、 肠、 肠 、 并 、 , 一 、 产 变 性 蛙 鱼 精 子 的预 杂 交 缓 冲 液 , 中 进 行 预 杂 交 ,小 时 , 以 减 少 探 针 在 滤 膜 上 非 杂 交 性的 吸 附 。五 斑 点 杂 交在 上 述 预 杂 交 液 中 分 别 加 人 体 积 的各 个 变 性 一 水 浴 中 加 热 分钟 后 , 立 即 在 冰 水 浴 中 冷 却 组 成 杂 交 缓 冲 液 ,和 预 杂 交 后 的 膜 进 行 分 子 杂 交 、小 时 。六 杂 交 后 的 洗 脱 和 检 测分 别 用 、 外 和 、并 溶 液 在 室 温 下 洗 脱 分 钟 并 在 一 范 围 内 温 度 梯 度 为 洗 脱 分 钟 ,将 膜 烘 干 , 分 钟 后 将 每 个 膜学 通 报 , 一 年 一 ,斑 点 剪 下 , 用 闪 烁 计 数 器 测 定 每 个 斑 点 的 放 射性 强 度 。结 果一 斑 点 杂 交因 为 和 病 毒 的 链端 不 含 有 多 聚 腺 核 昔 酸 , , 因 此 , 木实 验 所 有 的 合 成 都 采 用 由 裂解 牛 胸 腺 后 的 短 片 段 做 随 机 引物 , 根 据 我 们 的 实 验 经 验 , 用 在 下 裂 解 牛 胸 腺 个 小 时 , 所 得 到 核 昔 酸片 段 只 有 一 个 碱 基 残 基 务 的 碱 性 琼 脂 糖凝 胶 电 泳 测 定 大 小 。 用 此 引 物 来 合 成 。的 效 率 较 高 , 而 且 一 , , 一 在 中的 结 合 率 也 高 。 将 点样 到 硝 酸 纤 维 膜 上 以 前 , 没 有 必 要 将 进行 变 性 处 理 , 不 变 性 的 可 以 牢 固 地 结 合在 膜 上 。二 序 列 同 派 性斑 点 杂 交 后 , 将 每 个 膜 斑 点 在 严 格条 件 下 洗 脱 、 务 溶 液 , 在 下 洗 脱 分 钟 , 以 除 去 非 特 异 性 杂 交体 。 然 后 将 每 个 和 同 源 或 异 源杂 交 后 的 斑 点 剪 下 , 用 闪 烁 计 数 器 测 定 每 个 斑点 的 放 射 性 强 度 , 计 算 出 每 个 与 异 源序 列 同 源 性 的 百 分 比 , 表 。从 表 结 果 得 出 在 番 茄 丛 矮 病 毒 组内 , 一 些 病 毒 相 互 之 间 有 较 高 的 同 源 性 ,如 和 、 和 、等 测 定 出 各 病 毒 相 互 之 间 同 源 性程 度 。 和 其 它 病 毒 之 间 的 同 源 性顺 序 依 次 为 外 、 肠 、汤 、 沁 、 务 。和 其 它 病 毒 之 间 同 源 性 顺 序 依次 为 多 、 多 、肠 、 外 、 并 。 同样 , 我 们 也 可 看 出 、 、 和其 它 病 毒 亲 缘 关 系 的 程 度 。 很 明 显 , 与其 它 病 毒 的 亲 缘 关 系 都 较 远 。, , 年 一 微 生 物 学 通 报 一 弓 ,农 茄 丛 级 润 毒 组 各 成 员 之 间 序 列 同 洲 性 百 分 比以 各 种 为模 板 的病 毒 的 入 、月口咤口自弓八甘,甘已三,翻 即今厄昌二 , ,压三口,叨几砚,乙二二胜三,八三 ,工、,盆, 二舀甘 ,弓沙 ,且臼矛,八内 ,二二日月口矛孟内 ,几,盛二注 表 中 同 源 性 百 分 比 值 均 为 两 次 质 复 的 平 均 值三 一 杂 交 物 的 熔 解 曲 线当 一 与 同 源 或 异 源 的 杂交 时 , 固 定 在 膜 上 的 和 八 形 成 杂 交体 , 为 了 除 去 非 特 异 性 杂 交 体 和侧 定 同 源 的 杂 交 体 的 热 稳 定 性 ,在 一 范 围 内 进 行 严 格 漂 洗 , 漂 洗 后 , 测定 每 个 膜 斑 点 的 放 射 性 图 。 。与 一 一 之 间 的 杂 交 物 值较 高 , 说 明 与 一 和之 间 有 较 多 的 碱 基 配 对 , 因 此 它 们 之 间 有较 高 的 同 源 性 。 和 一之 间 的 杂 交 物 值 低 一 ” , 这 说明 它 们 之 间 核 普 酸 序 列 的 同 源 性 低 , 这 些 结 果与 表 测 定 序 列 同 源 性 百 分 比 的 结 果 一致 。温 度 周 一 的 和 组 内 不 同 病 毒 之间 杂 交 物 的 热 熔 解 曲 线一 人 入 生 一 人 一 一一 一 心 人 一 一一 火 一 今 一 一各 病 毒 的 口 值 二 , 写 , 二 ,丁 , 二 ,二 讨 论近 几 年 来 , 核 酸 的 分 子 杂 交 技 术 日 趋 完 善 ,以 不 同 材 料 为 支 持 物 的 固 相 杂 交 技 术 取 得 了 更为 迅 速 的 发 展 习 。 在 植 物 病 毒 方 面 , 最 初 将固 定 在 硝 酸 纤 维 膜 上 的 固 相 杂 交 技 术 是用 来 检 测 植 物 汁 液 中 的 病 毒 和 类 病 毒 , 经 试 验证 明 这 一 方 法 同 样 可 以 用 来 检 测 病 毒 序列 同 源 性 。 斑 点 杂 交 法 具 有 简 便 、 快 速 的 特 点 ,而 且 样 品 比 较 集 中 , 灵 敏 度 高 。 因 为 以 病 毒为 模 板 合 成 的 互 补 能 代 表 整 个 病毒 基 因 所 携 带 的 遗 传 信 息 , 而 血 清 学 技 术 和 外壳 蛋 白 亚 基 的 氮 基 酸 组 成 及 顺 序 都 只 能 代 表 整个 病 毒 所 携 带 遗 传 信 息 的 一 小 部 分 ,因 此 , 用 分 子 杂 交 技 术 测 定 不 同 病 毒核 昔 酸 序 列 的 同 源 性 , 并 进 行 病 毒 的 分 类 是 理想 的 , 也 是 可 行 的 。将 本 实 验 结 果 和 血 清 学 测 定 结 果 田 进 行 比较 表 , 可 以 看 出 大 多 数 序 列 同源 性 百 分 比 和 值 相 近 我 们 能 从 杂 交结 果 直 接 看 出 各 之 间 的 亲 缘 程 度 , 而值 仅 能 表 示 各 病 毒 之 间 血 清 学 关 系 的 紧 密 程度 和 之 间 有 多序 列 同 源 性 , 而 值 则 表 示 它 们 之 间哥卞粗椒嵌微 生 物 学 猫 报, 分 子 杂 文 法 侧 定 的 日 , 性 百 分 比 和 血 劝 学 别 指 段 的 比 较, 年病病 了人 人同同 抓 性 百百 今今 , , ,分分 比比比比比比比比比比比比血血 演 学 鉴鉴 , , , , ,别别 指 数数数数数数数数数数数数注 血 演 学 鉴 别 指 数 愈 小 , 病 毒 亲 缘 性 关 系 愈 高 , 反 之 亦 然没 有 血 清 学 关 系 。 另 外 , 和 的序 列 同 源 性 百 分 比 和 值 也 有 差 异 ,这 些 差 异 可 能 是 由 于 血 清 学 方 法 的 局 限 性 所致 。 为 了 进 一 步 揭 示 番 茄 丛 矮 病 毒 组 序列 的 同 源 性 , 可 通 过 对 每 个 病 毒 的 碱 基序 列 进 行 分 析 。 我 们 希 望 这 一 技 术 也 象 。杂 交 技 术 一 样 , 经 不 断 改 进 成 为 确 定 病 毒 基 因之 间 同 源 性 的 有 力 工 具 。考 文 献亡 二 犷 , ,一 ,。 。 川 。, ,川 七三 一 , ,功 了 ,弓 】 片飞 亡 考 人 月 行 ” 脚 , , ,弗 州 新 接 合 霉 在 桔 全 爪 蜻 中 的 流 行黄 耀 坚 邱 丽 绚 郑 本 暖福 建 休 学 院 , 南 平摘 典 , , 。 年 春 发 生 于 福 建 南 平 市 郊 桔 全 爪 满 群 体 的 虫 稼 流 行 病 , 其 病 原 鉴 定 为 弗 州 新 接 合 称经 枣 力 、 宿 存 力 以 及 传 播 途 径 等 初 步 考 察 结 果 表 明 该 菌 具 有 较 高 的 流 行 能 力 。 流 行 病 的 消 长 显 示果 园 的 郁 闭 度 和 降 雨 里 是 影 响 疾 病 流 行 的 主 要 生 态 因 子 高 郁
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