提取分离纯化苦参中氧化苦参碱的工艺研究

苏州大学本科生毕业设计（论文）1苦参的提取纯化工艺研究实习生：药学院 07 中药 高顼指导老师：徐丽华摘要目的：通过大孔树脂分离纯化苦参中生物碱类成分（氧化苦参碱为主）的过程中树脂的筛选、吸附洗脱工艺的研究，确定提取分离纯化苦参中氧化苦参碱的工艺路线。方法：采用正交试验和大孔树脂分离法对从苦参药材中提取氧化苦参碱的提取分离工艺进行研究。结果：氧化苦参碱提取率 85%左右，树脂柱的转移率在 80%以上。结论：14+12 倍量的 40% 乙醇回流提取 1.5+1.5 小时，为苦参的最适宜的提取方法，300g 药材量上柱（对应 600ml 的 B 大孔树脂） 、pH 7、80% 乙醇洗脱氧化苦参碱的转移率最高、除杂率也很高，适合氧化苦参碱的分离纯化。关键词：苦参；氧化苦参碱；大孔树脂；提取分离纯化 AbstractPurpose：The research of Selection of resin 、Adsorption、Elution from the process of purification Alkaloids（based oxymatrine ）in flavescens by macroporous resin to determine the extraction and purification process oxymatrine line. Methods:By the way of orthogonal and macroporous resin separation Extracted from Sophora flavescens extraction process oxymatrine study.Results:Extraction rate of oxymatrine is about 85%, resin transfer rate is 80% or more. Conclusion: 14+12 times 40% ethanol refluxing 1.5+1.5 hour is the most suitable method for the extraction of Oxymatrine, 300g quantity column medicine (Corresponding 600mL B Macroporous resin )、pH7、80%Ethanol Elution Elution The maximum transfer rate, purification for oxymatrine.Keywords: Flavescens;Oxymatrine;Macroporous resin;Extraction and purification苏州大学本科生毕业设计（论文）2前言1 简介氧化苦参碱又名苦参素。植物来源：本品系从豆科属植物苦参(Sophora flavescens Ait.)或平科植物 广豆根( Sophora subprostrata Chun et T.Chen)中分离出来的生物碱。英文名称： Oxymatrine。熔点及溶解度：mp.162163（水合物） ，207（无水物），溶于水，氯仿，乙醇，难溶于乙醚，甲醚，石油醚。分子式及分子量：分子式C15H24N2O2；264.36。有效成份： Matridin-15-one,l-oxide.(1)-;C15H24N2O2。2 药理作用氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒作用，可降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内 HBsAg 和 HBcAg 的含量，且对两者作用一致，无选择性作用，氧化苦参碱是一种较强的免疫抑制剂，可以抑制多种炎性因子的释放，有明确的抗炎作用，对 IL-2 诱导的 LAK 细胞杀瘤活性亦有较强抑制作用，故氧化苦参碱通过 IL-2 等细胞因子发挥其抗乙型肝炎病毒作用的可能性不大。 苦参的西方用途：苦豆子 sophora 植物的原植物和热水粗提物在西方应用历史已经有 25 年了。最初含有 20%氧化苦参碱和苦参碱的苦豆子生物碱提取物由窗同药物研究所引进西方市场，形式为氧化苦参碱片 in tablet form under the name Oxymatrine，1998年上市。其使用并无任何副作用。在中国，苦参生物碱通常采用注射形式，但在西方不接受该方法，而是采用口服形式。口服后，大部分的氧化苦参碱被转化成了苦参碱；而如果需要氧化苦参碱的高血液浓度，则必须依靠注射。但是临床试验中氧化苦参碱的疗效是否好于苦参碱不得而知。中国的研究者们也使用片剂的苦参生物碱，效果似乎和注射差不多。苦参也可以作为中药煎服。 苦参中含有大量的生物碱，其中含量最高的是苦参碱和氧化苦参碱，加总占苦参药材根干总重的 2%(其中大部分以氧化苦参碱的形式存在)，同时还有其他的相近的生物碱：其中主要是槐果碱(Sophocarpine,C15H22N2O) ，还含有少量的槐醇 sophoranol,槐胺sophoramine,槐啶碱(Sophoridine)allomatrine, 异苦参碱(Iosmatrine)等其他生物碱成分。苏州大学本科生毕业设计（论文）3实验仪器、药品和试剂1 仪器岛津液相色谱系统：检测器（SPD-10A）、泵（LC-10AT）电热恒温水浴锅（XMTD-4000，上海科恒实业发展有限公司）电热型恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A），巩义市予华仪器有限公司电热回流提取装置：电热套（PTHW，巩义市予华仪器有限公司）、圆底烧瓶（G.G.-1，10000ml）天平：马头牌 JYT-5 架盘药物天平（上海医用激光仪器厂）树脂柱（特制，直径 5cm，高 100cm）、蒸发皿（100mL）、量筒（1000mL）2 药品和试剂甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）盐酸、氢氧化钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司，试验用各浓度乙醇均由该浓度乙醇配制）A、B、C 大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司，3 种大孔吸附树脂因涉及到商业机密故用 A、B、C 代替）氧化苦参碱标准（中国药品生物制品鉴定所）苦参(安徽亳州药材市场购买)苏州大学本科生毕业设计（论文）4第一章 氧化苦参碱 HPLC 检验方法 根据 2010 版中国药典选择氧化苦参碱为指标成分，并根据参考文献和经验，摸索建立了适合该品种的氧化苦参碱含量测定方法。具体检测方法如下：对照品溶液的制备：精密称取氧化苦参碱对照品适量，用甲醇配制成质量浓度为0.21mg/ml。色谱条件：cosmosil AR- 柱，流动相为乙腈-0.36% 磷酸（10：90），柱温为 25，流速 1.0mL/min，AuFs 0.01，检测波长为 220nm。供试品溶液的制备：精密吸取 1mL 工艺留样，以 60%甲醇稀释 10 倍，离心 10 分钟，取上清液进样。药材中氧化苦参碱的测定：取苦参粉末 1g，置锥形瓶中，加入 80%甲醇 100ml，超声提取 10 分钟，微孔滤膜过滤，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10L 进样。计算得药材中氧化苦参碱的质量分数为 3.25%、4.16%、3.86%。上述有关 HPLC 的部分均由相关人员完成，本人只负责 HPLC 测定后实验数据的处理。苏州大学本科生毕业设计（论文）5第二章 提取分离纯化苦参中氧化苦参碱的工艺研究2.1 提取工艺1 粉碎度的考察：取苦参饮片（氧化苦参碱含量 3.25%）3 份每份 300g，分为 1、2、3 组：第 1 组饮片剪碎处理，将饮片剪至 1-2cm 的规格；第 2 组饮片处理成粗颗粒，用锤子将饮片处理成约 0.5cm 的规格；第 3 组打粉处理，将饮片用打粉机处理然后过筛，约 50%的饮片被处理成粉末并且能过 20 目的筛网，剩余的饮片打粉后为纤维状无法过筛网，称取药材时按比例称取粉末和纤维。上述 3 组药材按照不同的方法处理完后进行氧化苦参碱的提取，提取的方法相同：处理后的药材用 14 倍量水（即 4200ml 水）煮沸提取 1.5 小时，倒出一煎液，再加入 12倍量水（即 3600ml 水）煮沸提取 1.5 小时，倒出二煎液。每组对应的一煎液二煎液量体积取样进行 HPLC 分析。该次试验用的苦参，氧化苦参碱含量为 3.25%，故 300g 药材中含有的氧化苦参碱的质量为 9750mg。表 1：不同粉碎度苦参饮片的氧化苦参碱的转移率粉碎度 体积（ml）氧化苦参碱质量（mg）转移率（%）一煎二煎总转移率（%）碎片 4000 6249.94 64.103400 1350.16 13.8577.95粗颗粒 3600 6011.20 61.653800 1410.92 14.4776.21粉末 3400 5484.87 56.263800 1425.78 14.2670.88从试验的数据看出，第 1 组的氧化苦参碱的提取率略高于其他两组，且第 1 组的药材饮片的处理较其他两组都要简便，故选用第 1 组的处理方法即将药材饮片处理成 12cm的片段作为饮片预处理的方法。粉碎是中药前处理过程中的必要环节，通过粉碎可增加药物的表面积，促进药物溶苏州大学本科生毕业设计（论文）6解与吸收，加速药材中有效成分的浸出。但粉碎过细，药粉比表面积太大，吸附作用增强，反而影响扩散，影响提取效率。苦参是根类药材提取时粗颗粒为宜，实验结果也证明了药材处理的过细会影响氧化苦参碱的提取率，12cm 的片段最适宜氧化苦参碱的提取。2 浸泡时间考察：取苦参饮片（氧化苦参碱含量 3.25%）3 份每份 300g，将饮片处理成 12 厘米的片段，3 份饮片分别浸泡 0 小时、2 小时、4 小时1，提取的方法为回流提取法，加 14 倍量水和 12 倍量水煮沸 1.5 小时，药液放冷后滤过，每份的一煎液和二煎液的滤液分别取样进行 HPLC 的含量测定。0 小时、2 小时、4 小时浸泡后氧化苦参碱的转移率分别为69.89%、69.17%、67.35%，由此可得出，浸泡时间对氧化苦参碱的提取基本无影响。表 2：不同浸泡时间苦参饮片的氧化苦参碱的转移率浸泡时间 体积（ml）氧化苦参碱质量（mg）转移率（%）0 小时 3500 5257.923600 1526.3969.092 小时 3400 5240.253400 1503.4269.174 小时 3700 5424.033500 1142.4167.36氧化苦参碱在热水中较高的溶解度和热稳定性，药材饮片浸泡的时间虽然不同但是在提取时加入的溶剂量和煮沸的时间是相同的，由于氧化苦参碱在热水中溶解度较高和热稳定性的性质可能是导致浸泡时间对氧化苦参碱的提取率影响较小的原因。3 苦参提取正交根据极性的强弱和经验将溶剂的含醇量分为 0%、40%、80% 3 种2 3 4。一般中药提取的时间为 1 小时，故选取 0.5、1.0、1.5 这 3 个不同的提取时间来提取5。溶剂量7 8一般以 12 倍量为准，二煎由于有效成分在一煎时已经被提取了大部分故减少了 2 倍量，选取的溶剂量为 10+8、12+10、14+10 这 3 个不同的溶剂量。选取溶剂含醇量、溶剂量、提取时间为考察因素，以氧化苦参碱总转移率为指标，采用L 9(34 )正交表安排试验。表 3：苦参提取正交因素水平表水平因素 溶剂含醇量（%）溶剂量（倍数） 提取时间（h）苏州大学本科生毕业设计（论文）71 0 10+8 0.5+0.52 40 12+10 1.0+1.03 80 14+12 1.5+1.5表 4：苦参提取正交表组别因素 溶剂含醇量（%）溶剂量（倍数） 提取时间（h）1 0 10+8 0.5+0.52 40 12+10 0.5+0.53 80 14+12 0.5+0.54 0 14+12 1.0+1.05 40 10+8 1.0+1.06 80 12+10 1.0+1.07 0 12+10 1.5+1.58 40 14+12 1.5+1.59 80 10+8 1.5+1.5称苦参饮片（氧化苦参碱含量 4.16%）9 份，每份 300g，将饮片处理成小于 12 厘米的片段。苦参提取的装置是电热套，方法是回流提取。实验过程中，按照对应组别所示的条件进行试验。100ml 固体质量为蒸发皿和固体的总重减去蒸发皿重所得。表 5：苦参提取正交中各组氧化苦参碱的转移率及除杂率组别体积（ml）含量（mg）转移率（%）100ml含固体量（g）固体总量除杂率（%）1 4530 6365.21 65.10 1.59 72.027 91.162 5705 7978.36 70.75 1.25 71.312 88.813 7180 8671.59 67.94 0.91 65.338 86.724 6750 7660.75 76.66 1.09 73.575 89.585 4495 7148.84 67.30 1.69 75.966 90.586 5920 8190.18 65.68 1.14 67.488 87.867 5720 7190.76 74.42 1.47 84.084 91.448 6785 9753.76 82.53 1.13 76.671 87.27苏州大学本科生毕业设计（论文）89 4840 7385.14 65.85 1.47 71.148 89.62K1 203.79 216.12 198.25K2 209.58 220.58 210.85K3 222.80 199.47 227.07R 6.33 5.55 9.60除杂率=100%- 氧化苦参碱质量 /总固体质量，除杂率仅作参考 以下的除杂率均相同表 6：氧化苦参碱提取正交方差分析方差来源 平方和 自由度 均方 F 值溶剂含醇量 63.198 2 31.600 21.639溶剂量 82.691 2 41.350 28.310提取时间 139.761 2 69.88 47.850误差 2.9206 2 1.460由表 6 可以看出，溶剂含醇量、溶剂量、提取时间这 3 个变量的 F 值均大于 18，由此得出该 3 个变量对氧化苦参碱的提取都有较高的影响，实验结果表示第 8 组即 14+12倍量的 40% 乙醇提取 1.5+1.5 小时，氧化苦参碱的转移率最高，有 82.53%，因此第 8 组的提取条件最优，该组的除杂率 91.18%也很高。2.2 分离纯化工艺1 苦参纯化树脂类型的考察：苦参药材 3 份每份 300g（氧化苦参碱含量 3.25%）提取，抽取上清液，用 2%NaOH调滤液的 pH 为 7-8，调完 pH 后的滤液共有 2.07L，留样，均分为 3 份每份约为 6.9L，分别过 A、B 、C 大孔树脂柱，树脂量为 600ml，上柱速度为 3BV/h，水洗速度为 2BV/h，洗脱液为 90%乙醇共 4BV，洗脱速度为 1BV/h。A、B、C 柱的流出液分别为6300ml、6500ml、6400ml，分别留样进行 HPLC 测定。 A、B、C 柱的洗脱液分别为950ml、1055ml、1225ml，分别留样进行 HPLC 含量测定。表 7：3 种树脂用 90%乙醇对氧化苦参碱的洗脱效果名称 体积（ml） 氧化苦参碱质量（mg）转移率（% ）柱前液 6900 6264.76 100.00苏州大学本科生毕业设计（论文）9A 流出液 6300 1665.56 26.59B 流出液 6500 204.32 3.26C 流出液 6400 1858.96 29.67A 洗脱液 950 3401.56 54.29B 洗脱液 1055 5493.24 87.68C 洗脱液 1225 4178.74 66.70注：柱前液中氧化苦参碱的含量记为 100%结果：B 大孔吸附树脂对氧化苦参碱有较强的吸附效果，并被 90%乙醇洗脱，转移量为 5493.24mg，转移率高达 87.68%。选择树脂量为 600ml 由树脂柱的大小决定，600ml 树脂约占柱高的 1/3,A 大孔吸附树脂是中极性树脂，属于中药专用树脂，适用范围是三七皂苷、绿原酸、原花青素、花色苷、广枣黄酮、沙棘黄酮等化合物，B 大孔吸附树脂是极性树脂，适用于生物碱类化合物。C 大孔吸附树脂是极性树脂，属于中药专用树脂，适用范围是甜叶菊、茶多酚、蒽醌类、酚类、咖啡因、有机酸、黄酮类等化合物。氧化苦参碱、苦参碱是高极性的化合物，根据相似相容原理，在选用树脂时选择了中极性和极性的树脂，而没有选用极性较弱的大孔吸附树脂。因为还没做有关洗脱浓度的考察，选择极性高的 90% 乙醇洗脱，根据相似相容原理氧化苦参碱易溶于极性高的溶液，90% 乙醇极性高易于把氧化苦参碱洗脱下来。2 苦参树脂正交所有的组别树脂量均为 600ml，树脂为 B 大孔吸附树脂选取上柱量、上柱pH、乙醇洗脱浓度为考察因素，以氧化苦参碱总转移率为指标，采用L 9(34 )正交表安排试验。表 8：苦参树脂正交因素水平表水平因素 上柱量（g） 上柱 pH 乙醇洗脱浓度（%）1 300 5 702 400 7 803 500 9 90称取苦参饮片（氧化苦参碱含量 3.25%）6 份每份 600g，将饮片处理成 12 厘米的片段，用 3 个电热套分 2 次提取，提取时加水量为 14+12 倍量，提取时间为 1+1 小时。将6 份的提取液合并，放凉沉淀后抽取上清液，上清液共 52.4L。柱前液取样用 HPLC 法测定其氧化苦参碱的