陈梦霞乙酸乙酯段十大功劳叶化学成分研究II

毕 业 设 计学生姓名 陈梦霞 学 号 191202051学院 生命科学学院专 业 生物技术题 目十大功劳叶乙酸乙酯段化学成分研究（II)胡卫成指导教师（姓 名） （专业技术职称/学位）（姓 名） （专业技术职称/ 学位）2016 年 4 月毕业论文独创性声明本人郑重声明：本人声明，所呈交的毕业论文十大功劳叶乙酸乙酯段化学成分研究（II），是本人在导师指导下和实验小组成员协助下开展的研究工作及取得的成果。此论文除引用文献外所有实验方法和材料，以及相关数据都是真实的。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了确切的说明并表示了感谢。作者签名： 日 期： 淮阴师范学院毕业论文（设计）0摘要: 十大功劳植物系属灌木或小乔木，是我国制药工业的重要资源。它的叶子常作为中药，其化学成分具有多种生物活性以及药理作用。因此它具有很好的研究价值。本文对十大功劳叶化学成分进行研究，利用高效液相色谱，葡聚糖凝胶柱色谱，薄层层析监测，分离纯化十大功劳中的化学成分，再通过氢核磁共振和碳核磁共振谱，质谱确定结构。最后波普数据和已知的化合物对照分析得，鉴定为药根碱。关键词: 十大功劳叶，药根碱，硅胶柱层析，化学成分，结构鉴定Abstract：Mahonia bealei are belong to shrubs or small tree. They are the important resources in the pharmaceutical industry in our country. Their leaves are often used as a traditional Chinese medicine. Its chemical component contains a variety of biological activity and pharmacological effects. Therefore, they have great value in research. In this paper, in order to study their chemical components and structure ,we separate and purify the chemical component by HPLC, glucan gel column chromatography and thin-layer chromatography. Lastly, by contrast, their chemical properties and spectral data and reference, the structure was identified as Jatrorrhizine. Keywords: Mahonia bealei, jatrorrizine, silica gel column chromatography, chemical constituents, structural identification淮阴师范学院毕业论文（设计）1目 录1 前言 .31.1 十大功劳叶研究进展 .31.2 药根碱分布情况.41.3 药根碱制剂研究.4 2 实验部分 .42.1 实验试剂与仪器 .42.2 实验方法 .52.3 实验过程 .52.3.1 样品制备 .52.3.2 装柱，葡聚糖凝胶上样 .62.3.3 洗脱收集 .72.3.4 薄层色谱分析 .82.3.5 高效液相色谱制备 .92.3.6 核磁共振波谱分析和质谱分析 .103 实验结果 .113.1 高效液相色谱图 .113.2 核磁共振的氢谱图和碳谱图 .113.3 结构鉴定 .134 总结和展望 .13参考文献 .14致 谢 .16淮阴师范学院毕业论文（设计）21 前言现代人群生活节奏越来越快，很多疾病也接踵而至，如肥胖症，血压过高，糖尿病，癌症，白血病，心肌炎症等 1。很多研究发现，黄酮类和多酚类化合物可以提高免疫力，抗氧化，抗癌，对许多疾病有帮助 2。因此，从植物中提取可以这些可以利用的成分，挖掘有利于人类健康的物质是非常值得研究的。不论是从古代还现在，中医中药一直都我国医学界重要的文化遗产，几百年来，用中药治疗疾病，可以降低副作用，促进了我们中华民族的繁衍昌盛。近几年来，对植物的成分和提取不断深入，提取的天然药物被用于美容，减肥，医学养生等方面。我国中药技术历史悠久，地大物博，中药采集资源丰富，名扬四海，逐渐一步一步走向世界。随着科学技术手段的提高，用天然药物的热潮风靡于世界各国，尤其是西方的一些国家注重对天然药物的开发和利用 3。1.1 十大功劳叶研究进展十大功劳属植物属于小檗科，目前研究发现，十大功劳属约有 60 种，中国约 35 种主要分布在四川，云南，贵州和西藏东南部。该植物的根茎叶均可以入药。小檗科十大功劳属植物多为分布全国的传统药或民间药，目前该类研究主要集中在资源方面的调查、化学成分提取和研究和生药活性方面。十大功劳叶又称为黄柏树叶，属于小檗科十大功劳属植物，它干燥后的叶子可以作为药材，之前有文献记录含有药根碱，小檗碱，掌叶防已碱，木兰花碱等一些有效成分 4。它具有清热补虚，化痰止咳，治疗风热和风湿感冒感冒等功效 5。它是我国古代中草药的代表，可以防御和治疗肺痨咳血、头晕脚酸、腰酸腿痛、湿热痢疾、风热风热感冒、肿痛和疮疡等。十大功劳种类很多发现了很多，有关地理分布在植物和资源方面有一些报道。十大功劳属植物主要研究最多的是生物碱成分，已经分离了 25 种生物碱，是小檗碱，巴马亭，药根碱，氧化小檗碱，四氢药根碱，木兰胺，异波尔定，海罂粟碱，白蓬草坡芬，紫堇定，异紫堇定，紫堇块茎碱，异汉防已甲素，白蓬皱褶碱，黄小檗灵，水叶碱，黄皮树碱，巴芦奇碱，阿莫灵，尖刺碱，小檗胺，黄连碱，非洲防已碱 6。十大功劳对病虫害的防治也有研究。陈德眉 7等对阔叶十大功劳包括苗木繁育、选地整地、移栽定植、养护管理、病虫害防治等栽培技术进行介绍,并阐述其保护与抚育的重要性，提出野生资源保护的措施。1.2 药根碱分布情况淮阴师范学院毕业论文（设计）3药根碱主要是分布在高等植物中，以双子叶植物为主，低等植物如地衣和苔藓类植物中，目前为止尚未发现药根碱 8。小檗科，罂粟科，芸香科和豆科，黄连等植物中都含有较多药根碱。也有研究发现，同一科属或亲缘相近的植物，往往含有一定的药根碱。如小檗科植物阔叶十大功劳，狭叶十大功劳，安徽小檗，黑果小檗等都含有药根碱，地理上，分布在热带和亚热带地区 9。1.2 药理作用药根碱具有解毒抑制细菌生长作用。抗肿瘤作用，王利红研究黄连中生物碱药根碱对白血病细胞系细胞毒活性，研究结果表明药根碱细胞毒性作用明显。心血管方面，有抗心里衰竭和抗心律失常，治疗心肌炎等。降血糖作用还有其他方面的药理活性，比如清除氧自由基抗氧化，抗突变等多种生物活性。对免疫系统也有很大的作用，表现在 T淋巴细胞上 10。蛇皮廯和皮肤炎患者的六种真菌，药根碱也表现出极好的抑制作用。更有意义的是，药根碱对几乎所有的真菌都有抑制作用，这其中包括 5 种毛廯菌属、2 种小孢子菌属和表皮廯菌属，皮肤廯菌较之酵母菌更容易被药根碱抑制。1.3 药根碱制剂研究对该药的制剂研究表现在汤剂和洗剂两个方面。用于临床的含药根碱的制剂研究表现在片剂，丸剂，颗粒和胶囊，注射剂等方面。主要有双黄消炎片，黄连胺片，加味左均丸。制成了很多单味药，复方药，以及配方颗粒等。2 实验部分2.1 实验试剂与仪器实验试剂：经鉴定为小檗科植物十大功劳属植物十大功劳标本实验用水是美国 Millipore 公司纯水、超纯水系统提供 常用的有机试剂如下表：试剂 采购公司正己烷 石油醚 二氯甲烷 甲醇 南京化学试剂有限公司三氯甲烷 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 国药集团化学试剂有限公司浓硫酸 冰醋酸 上海久亿化学试剂有限公司乙腈和甲醇 江苏汉邦科技有限公司其他：葡聚糖凝胶，硅胶板，反向分析色谱柱，TLC 显色剂：紫外灯 254，365nm淮阴师范学院毕业论文（设计）4实验仪器：1.DHG-9240A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）2.KQ-500B 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）3.SHB-3 循环式多用真空泵4.RE-3000D 旋转蒸发器 5.ALPHA 1-2LDPLUS 冷冻干燥机（德国 ALPHA 公司）6.CBIO-UV6A 多功能暗箱紫外分析仪（北京赛百奥科技有限公司）7.1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）8.BS224S 电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）9.Direct-Q3CHAO 超纯是系统（美国密理博公司）10.液相色谱仪-质谱联用仪（美国 Thermo Electron 公司）2.2 实验方法2.3 实验过程2.3.1 样品制备（1）取十大功劳干燥的茎 3.5kg，与乙醇按 1:20 比例混合，超声提取，重复 3 次。（2）每次过滤，合并乙醇液，旋转蒸发回收乙醇，得乙醇粗取物浸膏。（3）乙醇粗提取物首先进行溶剂分组，根据不同极性由小到大的顺序依次萃取，减压浓缩，达到充分萃取。淮阴师范学院毕业论文（设计）5（4）冷冻干燥后，可以得到5个萃取相。经不同极性溶剂萃取后，乙酸乙酯段就是本实验下面用到的材料。2.3.2 装柱，葡聚糖凝胶上样 把玻璃柱洗干净，晾干，固定于铁架台上。样品经硅胶上样用 10:1 的氯仿: 甲醇溶液将硅胶搅拌，把硅胶浸泡液慢慢倒入玻璃柱中，倒完后关闭活塞。将样品通过漏斗均匀的倒入柱中。填料选择 SephadexLH-20 30g，加入甲醇 200mL，浸泡，垂直装好柱子。加入甲醇后，待填料稳定，上样后使其自然沉降 24h，流动相采用甲醇冲洗，流速为2ml/min。用蒸馏水和 100%的甲醇，配制 80%、60% 、40%、20%的甲醇溶液，制备洗脱剂进行下面梯度洗脱 11。图一为上样图淮阴师范学院毕业论文（设计）6图一2.3.3 洗脱收集准备好 50 个干净的小玻璃瓶，瓶子容量在 3-5ml,收集相应的组分。控制好活塞，即洗脱速度，大约 8ML 收集一管子。将收集好液体作薄层分析。样品是有颜色的，根据颜色判断样品的洗脱情况，当颜色接近时，用事先准备好的玻璃瓶分组收集。收集图如图二淮阴师范学院毕业论文（设计）7图二2.3.4 薄层色谱分析薄层色谱是利用混合物中各组分在某一物质中，当混合物流经该物质，经过反复分配，各组分因为极性不同而分开。它的优点是快速，灵敏，常用来指导样品的合并并且可以定性判断 12。薄层色谱由硅胶板，毛细管，展开剂以及显色剂等组成。按一定体积收集样品组分后，毛细管蘸取样品液，轻轻点在硅胶薄层板上面，待样点干后，放入密闭的展开缸中，点样的位置要在展开剂页面之上。展开剂是正丁醇：乙酸：去