冷冻干燥或交联制胰岛素壳聚糖纳米颗粒的设计,表征和生物效率译文

冷冻干燥或交联制胰岛素-壳聚糖纳米颗粒的设计，表征和生物效率M. Diopa, N. Aubervalb, A. Viciglioa, A. Langloisa, W. Bietigera, C. Muraa, C. Peroneta, A. Bekelb, D. Julien Davidc, M. Zhaoc, M. Pingeta, N. Jeandidiera, C. Vauthierd,E. Marchionic, Y. Frereb, S. Sigrista,*摘要: 胰岛素口服给药是理想的给药方式，但是由于胃肠道的苛刻条件没有效果。使用封装在自组装颗粒中的胰岛素的保护是有希望的方法。然而，这种颗粒在生物环境中的稳定性缺乏导致口服给药后封装的胰岛素的生物利用度低。这项研究的目的是评价冷冻干燥和交联两种稳定策略的单独或联合作用，对胰岛素负载的壳聚糖纳米粒的影响，并确定其体外和体内的生物有效性。通过胰岛素和壳聚糖之间的复合凝聚制备纳米粒，通过与三聚磷酸钠溶液（TPP）交联或冷冻-干燥或两种方法同时处理而稳定。体外纳米颗粒吸收的生物有效性通过流式细胞仪对上皮模型（Caco-2 / RevHT29MTX（粘液分泌细胞）评估。在体内，纳米颗粒通过导管注射在对胰岛素缺乏的大鼠的腹膜或十二指肠。与不影响纳米颗粒电荷但降低纳米颗粒尺寸（-25）的交联相比，冻干在尺寸和电荷上增加（+15 vs control 4127nm; + 360.3mV）。当两种方法组合时，与标准水平相比，连续处理降低纳米颗粒大小并增加电荷。没有冷冻干燥的，其中 60的纳米颗粒在 2 小时后被破坏，与没有冷冻干燥的相比，冷冻干燥是必需的，用以防止纳米颗粒在肠环境中的破坏。另外冷冻干燥结合交联处理时提高了纳米颗粒的生物效率，当存在粘液时细胞中的摄取增加。在体内两种处理的组合显示了其对胰岛素的保护，当施用纳米颗粒时具有降低血糖的作用。这项工作表明，冷冻干燥和交联处理的组合是必要的，以在体外和体内胰岛素的递送中稳定（冷冻干燥）和增加自组装纳米颗粒的生物效率（交联）。关键词：壳聚糖 胰岛素 纳米颗粒 口服 复合凝聚1.介绍皮下胰岛素注射广泛用于糖尿病治疗。然而，注射通常是痛苦的，导致患者依从性低（Al-Tabakha and Arida,2008）。通过最大限度地减少注射，可以增加患者依从性，从而提高治疗疗效。口服给药是递送药物方便舒适的方法，因为其消除了与注射相关的疼痛和创伤。 然而，由于胃肠道的恶劣条件，口服给药会使胰岛素在到达血流之前使蛋白质变性。例如，小于 0.1的口服胰岛素可以完好的地到达血流（Foss and Peppas,2004）。此外，低 pH 和蛋白酶介导的水解限制了完整胰岛素的肠吸收（Aoki et al.,2005）和转运到体循环中。因此，为了开发有效的口服糖尿病治疗剂，保护胰岛素抵抗胃肠环境是必要的。已经开发了改善胰岛素摄取的方法，包括吸收促进剂，化学修饰和纳米胶囊或纳米球中的包封。聚合物胶体系统在治疗性蛋白质的口服递送中表现出一定程度的成功。 正在进行许多研究以改善使用递送系统的生物活性大分子的口服生物利用度。由天然聚合物，例如壳聚糖配制的纳米颗粒（NPs）作为蛋白质的载体是有利益的（Sarmento et al.,2007）。壳聚糖对于纳米颗粒开发具有许多优点，包括生物相容性，生物降解性，低免疫原性和毒性（Agnihotri et al., 2004；Pandey et al., 2005）。壳聚糖的粘膜粘附性质与其高正电荷密度有关（Plapied et al.,2010）。因此，壳聚糖是药物递送到粘膜组织的理想物质（Sayin et al., 2009）。壳聚糖主链上的许多游离胺基团产生有利的性质，允许在药物递送应用中广泛使用。在酸性环境中，纳米颗粒自发形成，由于带正电荷和带负电荷的物质之间的分子内和分子间连接（Veis,2011），其形成聚电解质复合物（复合凝聚）。这个过程基于自组装的壳聚糖和胰岛素纳米颗粒，似乎有希望在不使用苛刻的有机化学品的情况下制备纳米颗粒。通过离子对和静电相互作用形成的纳米颗粒保留聚合物完整性。包括胰岛素在内的蛋白质的胃肠摄取可以通过包裹在纳米颗粒中来改善，纳米颗粒保护胰岛素免于降解。这些载体具有改善的口服肽递送，这是由于它们在胃肠道中的长期保留和由游离氨基介导的对粘液层的良好渗透（Renukuntla et al.,2013）。正电荷可以与许多带负电荷的表面反应，包括细胞膜，粘液衬里中的唾液酸和阴离子聚合物。这些颗粒系统还对带负电荷的大分子（Mohammadpourdounighi et al.,2010）显示高亲和力，例如粘膜表面上的粘蛋白。此外，它们被肠细胞吸收，肠吸收是主要的吸收途径。然而，壳聚糖是非肠溶聚合物。因此，壳聚糖纳米颗粒不能在胃环境中保护胰岛素。在专利 CA2522868（Belcourt et al.,2004）中提出了一种解决方案，其描述了基于含有保护肠中活性成分的纳米颗粒的胃阻力制剂的双重包封系统。在以前的研究中，我们开发了适合于大鼠十二指肠特异性药物递送的肠溶胶囊（Reix et al.,2012），其可以填充胰岛素 -壳聚糖纳米颗粒。在本研究中，我们评估了壳聚糖纳米颗粒在肠道条件下保护胰岛素的能力（Chaudhury and Das,2010）。然而，众所周知，在含有磷酸盐的环境中，复合凝聚是不稳定的。因此，这些复合物用作药物载体稳定。与三聚磷酸钠（TPP）的交联和冷冻干燥可能是一个有利的解决方案。三聚磷酸钠是具有三个带负电荷的磷酸基团的多价阴离子。该性质使其能够交联壳聚糖（Rekha and Sharma,2009）。冷冻干燥是在长时间内保存不稳定分子的公认方法，包括生物技术-药物，例如蛋白质和肽（Sameti et al.,2003）。纳米颗粒可以在三聚磷酸钠，壳聚糖和胰岛素的混合物中通过三聚磷酸钠磷酸酯和壳聚糖氨基之间的分子间和分子内连接自发形成（Wu et al., 2005）。本研究试图使用交联和冷冻干燥法制备稳定的胰岛素负载的壳聚糖纳米颗粒，并进行体外和体内生物效率的验证。2.材料和方法2.1.材料超纯的壳聚糖氯化物（CS Protasan UP CL113,75-90脱乙酰化，分子量70-150kDa）购自 Nova Matrix（FMC BioPolymer，德拉门，挪威）。商业人胰岛素溶液（Umuline1 100IU / mL）由 Eli Lilly Pharma（Indianapolis，IN，USA）大量提供。由 Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）提供人重组胰岛素，异硫氰酸荧光素标记的胰岛素，三聚磷酸钠溶液，D-甘露醇，异丙醇，胎牛血清（FBS ），胰蛋白酶，链脲佐菌素，24 孔板（CELLSTAR1 organic Greiner） MO，USA）。用于高效液相色谱（HPLC）的化学品是液相色谱级。乙腈来自 VWR（Fontenay-sous-Bois，France），无水硫酸钠来自 SDS（Peypin，France）。人腺癌细胞系Caco-2 获自 ATCC（美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，USA），RevHT29MTX 细胞系由 Dr.ThclaLesuffleur（INSERM U505，Villejuif ，France）提供。从 Invitrogen（Cergy Pontoise，France ）购买改良伊格尔培养基（DMEM），抗生素和抗真菌剂，非必需氨基酸溶液，谷氨酰胺，磷酸盐缓冲液（PBS）和 Hanks 平衡盐缓冲溶液（HBSS）。碘化丙啶和膜联蛋白-V 试剂盒购自 Clinisciences（Nanterre，France）。2.2.纳米颗粒制备将壳聚糖氯化物 CL113 溶解于重蒸水（1mg / mL w/v）中。 在微量磁力搅拌（300rpm）下，通过注射器向壳聚糖溶液（500mL ）中滴加等体积的胰岛素。 将混合物在室温下缓慢搅拌下维持 30 分钟以获得标准（STD）纳米颗粒。交联，将粉末溶解在重蒸水中来制备三聚磷酸钠溶液溶液（27mM）。 三聚磷酸钠溶液溶液（50L ）引入到络合介质中并搅拌 30 分钟（300rpm）以获得交联的纳米颗粒。在存在或不存在用作冻干保护剂的甘露醇的情况下，对天然或交联的纳米颗粒进行过夜冷冻干燥。甘露醇直接溶在纳米颗粒制剂（5mg / mL）中，然后冷冻干燥。 冷冻干燥后，将纳米颗粒以目标浓度分散在重蒸水中用于进一步分析。2.3. 纳米颗粒表征纳米颗粒的物理化学参数通过动态光散射使用 Malvern NanoZS（Malvern ，Instruments，Worcestershire，United Kingdom）在 25下在重蒸水中稀释至1:500。通过从纳米颗粒光散射强度的累积函数计算直径来确定平均纳米颗粒尺寸。还确定了全局表面电荷（ 电位）和多分散指数（PDI）。通过透射电子显微镜（TEM; Hitachi High Technologies Corporation，Tokyo，Japan）检查形态。在离心纳米颗粒分散体后测定包封效率（20,000g，41 小时）并通过高效液相色谱法定量上清液中没有包封的药物。该系统由两个 Prostar 210 溶剂递送系统，Prostar 410 自动进样器和 Prostar 330 光电二极管阵列（ PDA）UV / vis 检测器（Varian， Les Ulis，法国）和 Symmetry C18（ 4.6mm250mm，5m，300A）柱（Waters，Milford，MA，USA ）。洗脱液 A 由 pH2.3 的 0.2M Na2SO4 水溶液组成，洗脱液 B 是洗脱液 A 和乙腈（55:45，v / v）的混合物。流动相由洗脱液 A /洗脱液 B（42:58 ，v / v）的混合物组成，流速为 1mL / min。柱温度保持在 40，检测波长为 214nm。使用以下等式计算包载功效（EE）：EE（%）（胰岛素的封装量/胰岛素的理论总量）1002.3.1. 渗透压计算我们使用以下 Vant Hoff 方程计算渗透压（mmHg ）：=(M /用于粒度测量的稀释因子 )RT其中 M 是溶解物质的浓度（单位 mol / L）。R 是理想气体常数（0.08206L atm mol -1 K -1）。T 是在开尔文（293K）上表示的温度。物种浓度：壳聚糖3.310-9M.胰岛素 3.0110-4 M. 三聚磷酸钠溶液 1.28x10-3M. D-甘露醇 0.027 M.2.4. 透射电子显微镜 使用在真空下的电碳沉积物使云母片亲水化。将合成的纳米颗粒（2mL）置于切片上 1 分钟，并除去过量的悬浮液。铀 1的尿酸乙酯（1）加入到切片中，1 分钟后取出。通过 Tecnai G2 Sphera（FEI 公司，Hillsboro，NC，USA ）分析样品。2.5.药物释放在 37缓慢搅拌下，与磷酸盐缓冲液孵育预定时间：T x = 0,0.25,0.5,1,2 和4 小时。在 1280nm 测量从纳米颗粒释放的胰岛素的量。结果表示为胰岛素浓度的增加百分比，如下：(胰岛素 T0/ 胰岛素 Tx) 100。2.6.稳定性测试制备胃液（35mM NaCl，80mM HCl，pH 1.2）和肠内培养基（50mM KH2 PO4，15mM NaOH，pH 6.8）。将纳米颗粒与培养基在室温下孵育预定量的时间：T 0 = 0 小时， Tx = 0.5,1,1.5,2,4 和 7 小时。在 500nm（Abs）下测量样品的光密度。结果表示为光密度的降低百分比，如下：(Abs.T x/Abs.T0)1002.7. 纳米颗粒的生物验证2.7.1. 体外验证2.7.1.1.模型和细胞培养。 使用两种细胞培养模型：Caco-2 细胞和与 75Caco-2 和25RevHT29MTX 细胞的共培养物，以获得体外肠上皮模型，如 Nollevaux et al. (2006)。 细胞培养如 Reix et al. (2012)。 简言之，将细胞接种（73000 个细胞/ cm2）于补充有 20胎牛血清，1抗生素 - 抗真菌溶液和 1非必需氨基酸（10mM 储备溶液）的 DMEM 中。 使细胞在含有 5CO 2 的气氛中在 37下生长 21 天以获得肠细胞表型，并从第 30 代至第 60 代使用。将体外使用的纳米颗粒冷冻干燥，并且结果表示为几何平均值乘以荧光细胞的百分比。2.7.1.2. 壳聚糖的吸收 为了研究细胞中纳米颗粒的摄取，如 Reix 等人所述进行流式细胞术 （2012）。 将细胞在 24 孔板中培养 21 天，并与不含磷酸盐缓冲液的改良伊格尔培养基中的异硫氰酸荧光素-胰岛素负载的纳米颗粒（10IU /孔）孵育 4 小时。孵育后，用不含钙和镁的 Hanks 平衡盐缓冲溶液溶液洗涤细胞 3 次（10 分钟），并通过胰蛋白酶消化，离心并在 Hanks 平衡盐缓冲溶液中的悬浮分离。 悬浮后加入 2L 碘化丙啶和 2L 膜联蛋白 V-APC 用以评估细胞活力。 通过 BD LSR II 流式细胞仪（Becton Dickinson and Company，Piscataway，NJ，USA）一式三份分析样品，每孔记录 50,000 个事件。 结果表示为荧光强度的几何平均值乘以异硫氰酸荧光素标记阳性细胞的百分比。2.7.2.体内验证 所有动物实验根据欧洲健康指导委员会关于动物的护理和使用的实验程序（批准号：AL / 60/67/02/13）进行。将雄性 Wistar 大鼠（120-140g）置于具有调节温度（231）室的房间中的标准集体笼中。将大鼠保持在 12 小时光照/ 12 小时黑暗循环中，并喂以颗粒形式的标准实验室啮齿动物饮食（SAFE A04，Villemoisson-sur-Orge，France ）。食物和水随意获得。通过腹膜内单次注射链脲霉素（75mg / kg）诱导糖尿病。 3 天后形成糖尿病（血糖 6g / L 和C-肽100pM）。糖尿病大鼠经历手术以植入腹膜内（IP）和十二指肠（ID）导管。导管的近端皮下穿透以在颈部后部离开，并缝合。手术后两天，通过十二指肠途径向动物施用 10IU 胰岛素，通过腹膜内途径施用 2IU 胰岛素。 纳米颗粒生物功能通过在腹膜内治疗的大鼠中每 30 分钟评价空腹血糖 4 小时，并且每小时治疗 12 小时治疗的十二指肠。2.8. 统计分析 使用 Statistica 版本 10（StatSoft，USA）和 GraphPad Prism 4（USA ）分析数据。 结果表示为平均值 标准误。 所有数据通过单因素方差分析 Tukey HSD 检验法，事后检验进行物理化学和体外分析。进行重复测量方差分析测试用于体内研究。 当 p 0.05 时，认为差异显着。3.结果3.1. 纳米颗粒表征 标准纳米颗粒为 4127nm， 电位为+361mV（表 1）。 没有甘露醇的冷冻干燥显着增加了纳米颗粒尺寸（49026nm）和 电位（+441mV）。用甘露醇冻干显着减小尺寸至 3685nm 和 电位至+422mV。交联的纳米颗粒为3467nm， 电位为+360.8mV。 具有或不具有甘露醇的冷冻干燥和交联的组合保持了纳米颗粒大小（分别为 3132 和 32619nm）和 电位（分别为+421和+421mV）。 所有的纳米颗粒具有小于或等于 0.4 的多分散指数。透射电子显微镜图像显示平滑和球形的纳米颗粒，并且该形态在冷冻干燥后保留（图1）。 高效液相色谱法测量表明标准和交联的纳米颗粒的截留效率分别为 61和 69（图 2）。表格 1 冷冻干燥和交联过程对负载胰岛素的壳聚糖颗粒的物理化学特性的影响。标准纳米颗粒交联的纳米颗粒冷冻干燥 甘露醇冻干标准纳米颗粒交联纳米颗粒标准纳米颗粒交联的纳米颗粒尺寸标准差(nm) 4127 3467a 49026 3133a,b 3683a,b 32619b,c多分散指数 0.30.06 0.310.04 0.40.08 0.30.06 0.30.07 0.30.05 电位标准差(mV) +361 +361 +441a +0.31c +422a +431c动态光散射测量，数据以平均值标准差表示。 应用单因素方差分析 Tukey 法比较所有组。a.p 0.05 与标准纳米颗粒比较.b.p 0.05 与不含甘露醇的冷冻干燥的纳米颗粒比较。c.p 0.05 与冷冻干燥的具有甘露醇的纳米颗粒比较。图 1.胰岛素负载壳聚糖的透射电子显微镜。冷冻干燥前（A）和冷冻干燥（B）后装载胰岛素的壳聚糖颗粒的结构。交联颗粒具有相同的方面（未示出）。图 2.壳聚糖颗粒的包封效率。 包封的胰岛素的高效液相色谱法定量（欧洲药典方案），象形图（ ）代表标准纳米颗粒，（ ）是用于交联的纳米颗粒。通过平均值标准差表示颗粒，进行 t 检验（n = 3 批合成） *p 0.001。3.2. 纳米颗粒稳定性测试 当不同的纳米颗粒制剂在水中孵育 7 小时时，没有观察到光密度的变化（图 3）。纳米颗粒立即溶解在模拟胃介质中，不管配方法（图 3，红色）。在模拟的肠介质（图 3，绿色）中，标准纳米颗粒在 1 小时后迅速破坏，84在7 小时溶解。相比之下，20的冷冻干燥的纳米颗粒，有或没有甘露醇，在 30分钟内溶解。这些纳米颗粒稳定 7 小时。图 3.模拟胃和肠介质中壳聚糖颗粒制剂的稳定性试验。（对于文本中对颜色的引用的解释，读者参考本文的 web 版本。） 通过在模拟介质中随时间推移浊度的演变进行稳定性测量。去离子水中颗粒的稳定性表示为黑色，肠介质为绿色，胃介质为红色。模式（ ）是用于非冷冻干燥的标准或交联的纳米颗粒，（ ）用于冷冻干燥的纳米颗粒和（）用于用甘露醇纳米颗粒冷冻干燥。结果以比率表示：通过测量的吸光度T0 在 Tx 处测量的吸光度。数据以平均值标准差表示，应用方差分析（重