光甘草定透皮吸收的影响因素探讨

天 津 中 医 药 大 学 本 科 毕 业 论 文光甘草定透皮吸收的主要影响因素的研究学 院 中药学院 专 业 药物制剂 学生姓名 赵丽娜 学 号 201014080099 指导教师 王艳老师 天津中医药大学2013 年 5 月毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。特此声明。论文作者签名： 日期： 学位申请人：赵丽娜指导老师:王艳授予单位：天津中医药大学答辩日期：目录摘要 .- 4 -Abstract .- 5 -论文正文 .- 6 -1 绪言 .- 6 -1.1 光甘草定 .- 6 -1.2 经皮给药系统 .- 6 -2 光甘草定透皮吸收实验 .- 7 -2.1 主要试剂与仪器 .- 8 -2.2 光甘草定含量分析方法的建立 .- 9 -2.3 光甘草定透皮吸收评价方法的建立 .- 9-2.4 光甘草定透皮吸收影响因素试验 .- 11-3 实验结果 .- 13 -3.1 光甘草定含量分析方法 .- 13 -3.2 光甘草定透皮吸收实验 .- 16 -3.3 动态方程的拟合 .- 19-4 结论与讨论 .- 20-参考文献 .- 20 -文献综述 .- 22 -经皮给药系统的研究进展 .- 21 -综述 参考文献 .- 26 -译文 .- 29 -译文原文 .- -致谢 .摘 要目的：研究影响光甘草定透皮吸收的主要因素，为光甘草定在化妆品中的应用提供依据。方法:采用体外透皮实验，以光甘草定在不同接收液中的累积透过量为指标,筛选最佳收液，作为本实验的接收液进行研究；制备光甘草定的凝胶剂及 O/W 乳剂两种不同剂型，进行试验，研究不同剂型对其透皮吸收的影响；根据预实验考察，选择具有代表性的氮酮、冰片、丙二醇、水杨酸、环糊精作为研究对象进行实验，采用单因素考察法考察同一用量(5%)各促渗剂的累计透过量，再比较不同用量(2%、5%、10%)的促渗剂的累计透过量，从而得到优选促渗剂的最佳用量。结果：在筛选接收液的实验中，50%乙醇-生理盐水累计透过量最高，其次为 30%乙醇生理盐水，15%乙醇-生理盐水、生理盐水组、PBS 组基本不透过，但实验中发现 50 乙醇-生理盐水组反渗效果过于明显，故本实验选择 30%乙醇-生理盐水作为最佳接收液进行下一步实验；在剂型影响实验中，光甘草定凝胶剂 12h 累计透过量为 202.22ug/cm2，累积透过率为 13.42%，光甘草定普通乳剂的 12h 累计透过量为 39.02ug/cm2，累积透过率为 2.59%。在筛选最佳促渗剂实验中 5%氮酮组透皮效果最好，最后进行浓度筛选，分别对 2%、5%、10%氮酮进行体外透皮实验，结果表明，2%透皮效果最好，故最佳促渗剂为 2%氮酮。结论:光甘草定具有较高的酪氨酸酶抑制率，具有很好的抗氧化能力，且稳定性良好；通过实验研究不同接收液、不同剂型及不同促渗剂对光甘草定透皮吸收的影响，并确定加入 2%氮酮后透皮效果显著增加，为后期光甘草定透皮吸收的研究提供了依据，同时也增加了光甘草定在化妆品的应用范围。关键词: 光甘草定；促渗剂；透皮吸收。AbstractObjective: Methods: Results: Conclusion： Keywords: 论文正文1. 绪言1.1 光甘草定光甘草定（Glabridin）为异黄烷类物质，是光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中所特有的脂溶性异黄酮类成分 1，约占甘草总黄酮类成分的 11%，分子式 C20H20O4，结构式如图（1），相对分子质量为 324.48；不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂；其特征吸收波长为 230 nm，282 nm 和 309 nm 23。光甘草定在光果甘草中的含量极低，约为 0.18%左右 6，其生物活性和药理作用研究目前成为植物类天然活性成分的研究热点之一 4， 而其低毒性更是为光甘草定在药物、化妆品与食品中的添加应用提供支持，研究表明其具有较强的抗氧化及明显的抗动脉粥样硬化和一定降血脂、降血压作用，在心脑血管疾病防治药物方向显示出较好的研究前景 5。此外，由于其显著的抗炎和美白效果，国际上将光甘草定公布为已核准许可的、最安全、最有效美白成分之一，在世界化妆品界，被誉为“美白黄金” 1。图 1 1.2 经皮给药系统 78：经皮给药是药物通过人体皮肤吸收的一种给药途径。根据药物分子靶向区域的不同，可分为局部经皮给药系统 (topical or dermaldelivery systems) 与透皮给药系统 (transdermal delivery systems)。对局部给药系统，表皮是药物分子的靶向区域；而透皮系统则以药物分子穿透皮肤进入体循环为目的。相对其它给药途径而言，经皮给药避免了肝脏的“首过效应”和药物在胃肠道的降解，降低了胃肠道因素对药物吸收的影响；通过缓/控释经皮给药系统可减少给药次数，延长给药间隔，实现按需要的速率给药；避免了口服给药等引起的血药浓度峰谷现象，降低了药物的毒副作用；对于某些局部皮肤疾病可以直接起作用；而且经皮给药系统使用方便，特别适合于婴儿、老人和不宜口服的患者。然而由于皮肤的天然屏障作用，使经皮给药的应用收到了很大的限制，主要影响药物透皮吸收的因素有:(1)生理因素：皮肤的渗透性是影响经皮给药的重要因素，动物的种属、年龄、性别、用药部位及皮肤的状态都会影响药物的透皮吸收。(2)药物的理化因素：例如药物的分子大小，溶解性及药物的存在形式。一般而言，分子量在 100 和 800 之间并且具有一定的脂溶性和水溶性的药物能渗透入皮肤。而药物的分子形式较离子形式更易透过皮肤被吸收。(3)药物的剂型：药物从不同的药物剂型中释放出来的越快，越容易被吸收，常用剂型有乳膏剂，凝胶剂，贴剂，水剂等。(4)透皮吸收促进剂：即促渗剂指那些能提高或加速药物渗透穿过皮肤的物质，分为化学合成透皮促进剂和天然透皮促进剂。(5)其他，药物的用量及作用时间，离子导入技术的应用等 二、光甘草定透皮吸收影响因素的的研究2.1、主要仪器、试剂及原材料2.1.1 主要仪器：高效液相色谱仪器 岛津 LC-20AT 型 日本岛津公司产品超声波清洗器 KQ-300B 型 昆山市超声仪器有限公司紫外分光光度计 UV-6100PCS 型 上海美谱达仪器有限公司数显恒温水浴锅 HH-2 型 河南石予华仪器有限公司万分之一分析天平:FA1004 Max 100g 上海精科天平改良 Franz 透皮扩散试验仪：TB-P6 型 上海谐凯科技贸易有限公司高效液相分析天平 上海精科天平2.2.2 主要材料及试剂：光甘草定提取物 实验室自行提取（经测定纯度为35.6%）光甘草定 标准品纯度98% 中国药品生物制品鉴定所甲醇：色谱纯 天津市康科德科技有限公司乙腈：色谱纯 天津市康科德科技有限公司冰乙酸：分析纯 天津市康科德科技有限公司乙醇：分析纯 天津市康科德科技有限公司氯化钠：分析纯 天津市康科德科技有限公司硬脂酸：分析纯 天津市化学试剂批发公司单硬脂酸甘油脂：分析纯 天津市光复精细化工研究所卡波沫 940 天津市光复精细化工研究所羟乙基纤维素 天津市光复精细化工研究所三乙醇胺 天津市康科德科技有限公司水杨酸;分析纯 天津市康科德科技有限公司丙二醇 天津芸熙生物技术有限公司冰片 天津芸熙生物技术有限公司氮酮 天津芸熙生物技术有限公司羟丙基-环糊精 山东省滨州智源生物科技有限公司生理盐水 实验室自制昆明种实验小鼠，体重 ( 20 3) g 天津中医药大学实验室提供娃哈哈纯净水 杭州娃哈哈公司生产2.2 光甘草定的含量分析方法的建立：2.2.1 检测波长的确定 ：取光甘草定标准品溶液，以流动相溶液为参比，用紫外-可见分光光度计对其在 500190nm 范围内进行扫描，确定最适检测波长。2.2.2 色谱条件：本实验采用以下色谱条件：固定相：Hypersil ODS 5m 柱（4.6mm200mm）流动相：乙腈：水：冰乙酸（55:44:1），此溶液经抽滤，在于超声仪中进行脱气处理 后再使用。流速：1ml/min进样量：10ul.柱温：室温检测波长：282nm。2.2.3 对照品的制备：精密称取 0.00222g 的光甘草定对照品于 5ml 容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，制得浓度为 0.444mg/ml 的母液。精密吸取 1ml 母液，于另一10ml 容量瓶中，流动相定容至刻度线，制成浓度为 0.0444mg/ml 的对照品液。2.2.4 供试品溶液的制备：称取光甘草定提取物 1.000g（精密称定）于 25ml 容量瓶中，用 50%乙醇溶解，定容至刻度线。即得供试品溶液。2.2.5 标准曲线的制备：分别依次进样 1ul, 2ul, 4ul, 6ul, 8ul, 10ul, 按以上色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标。采用 Matrix Laboratory8.1 软件绘制光甘草定的标准曲线。2.2.6方法学验证：（1）精密度考察：取对照品溶液（浓度为 0.00444mg/ml），按照色谱条件进行检测，于一天内连续测定 6 次，记录光甘草定峰面积，计算 RSD%得到日内精密度；并于连续6 天分别测定，记录光甘草定峰面积，计算 RSD%得到日间精密度。（2）稳定性实验：取对照品溶液（浓度为 0.00444mg/ml），按色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10，24h 进行检测，记录光甘草定峰面积，计算 RSD%。（3）方法回收率：制备高、中、低（0.0444mg/ml、0.0222mg/ml、0.00444mg/ml）三个浓度的光甘草定对照品溶液进行 HPLC 检测，根据标准曲线计算测定浓度，与实际配制的浓度进行比对，计算出方法回收率。2.3 光甘草定透皮吸收评价方法的建立2.3.1 HPLC 法（1）色谱条件见光甘草定的含量分析方法。(2)专属性实验将涂布不含光甘草定的空白乳剂的鼠皮作为空白组，涂布含光甘草定乳剂的鼠皮作为实验组，分别固定在 Franz 扩散池上,直接与接收室中的 30%乙醇-生理盐水接收液接触,分别在 12h 取接收液样品,其余操作同“2.3.4”，记录色谱图，考察该方法的专属性。2.3.2 实验装置本实验所用的透皮装置是立式 Franz 扩散池，如图（2）它由上下两个半池组成，上半部为给药池，下半部为接收池，中间有夹子固定。有效扩散面积为 3.14cm2 接收池体积为 8 mL，实验时用保鲜膜将上部缺口密封以防止水分蒸发。本实验采用智能透皮试验仪，如图 3 所示。图 2 立式 Franz 扩散池图 3 智能透皮试验仪2.3.3 离体鼠皮的制备与预处理取实验用白鼠，处死，分离腹部皮肤，将取下的腹部皮肤平铺于干净的玻璃板上。用刀片及镊子小心剔除鼠毛和皮下的脂肪组织及黏连物，用新配制的生理盐水反复冲洗干净，最后置于干净的培养皿中，加入生理盐水浸润鼠皮，密闭贮于低温冰箱（-20度）中保存，备用。实验前生理盐水解冻，仔细检查鼠皮的完整性，保证无任何破损。2.3.4 体外透皮吸收实验方法将处理好的鼠皮从冰箱中取出，用生理盐水泡至室温，用剪刀将皮肤剪成适当大小固定在扩散池上。角质层向上固定于 Franz 扩散池上，在接收池中加入 30%乙醇-生理盐水，放置于恒温水浴的智能透皮试验仪中，透皮仪设定温度（37 0.5) ，转速 200r/min.平衡一小时，排尽接收池内的气泡后给药。扩散池供给面积上均匀涂上1g 光甘草定乳剂或凝胶剂，每组平行 3 次，分别在0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h 时吸取接收液 1ml，并补入相同体积的接收液，将吸取的接收液经 0.45um 的微孔滤膜过滤，HPLC 法进样分析。2.3.5 数据处理：在药物经皮扩散实验中，一般而言药物的扩散是以零级动力学进行的。当药物的扩散达到稳态后，其稳态渗透速率 F 的表达式可以用公式（1）表示：i = n1F =(Cn V+ Ci V 100%)/Q 总 (1)n = 1为了处理数据方便，以单位面积累积透过量 Q（ug/ml）为纵坐标，时间 t（h）为横坐标作图得累积渗透曲线如下图，对曲线中的直线部分进行线性回归，稳态渗透速率 F（ug/ml*h） 和药物经皮渗透的滞后时间 T(h) 分别为此直线的斜率和在横轴上的截距。其中单位面积累计透过量 Q 的公式如公式（2）所示：i= n-1Q =（C n VR+ Ci Vi）/A (2)n= 1其中 Q 总 :供给池总浓度Q:单位面积累积透过量 ug/mlCn:第 n 个时间点吸取液的浓度 ug/mlCi:第 n-i 个时间点吸取液的浓度 ug/mlVR:接收液的总体积即 8.0ml,Vi:每次吸取的液体体积即 1ml,A:接收池的体积即 3.1416cm2.2.4 光甘草定透皮吸收的影响因素实验2.4.1 接收液的选择（1）光甘草定在不同接收液中的透皮吸收试验参照 2.3.4 法进行透皮吸收实验，接收池分别盛满 15%乙醇-生理盐水，30%乙醇-生理盐水，50%乙醇-生理盐水，生理盐水，PH6.8 磷酸缓冲溶液（PBS）、15%乙醇-PBS、30%乙醇-PBS 不同溶液 910，扩散池均匀涂上 1g 含光甘草定提取物 1%的乳剂。（2）光甘草定在不同接收液中的稳定性试验将不同溶解介质的光甘草定溶液置于（37 0.5) 的水浴锅中，隔水加热24h，观察不同溶液的颜色变化、是否分层等。2.4.2 不同剂型对