溶血检验PPT课件

第二节 溶血性贫血的实验室检测,广州医科大学附属第一医院黄 振 倩,1,溶血性贫血（hemolytic anemia）是由于各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，而骨髓造血功能不能相应代偿而发生的一类贫血。,2,溶血性贫血的分类：,3,1.按先天性、获得性和发病机理分类：,4,2.按溶血发生的部位分类：,血管内溶血：为红细胞在血管内（血液循环）中直接破坏，释放出血红蛋白到血浆中形成血红蛋白血症。多为获得性，常急性发作。血管外溶血：为红细胞在血管外，即脾脏等单核-吞噬细胞系统被吞噬破坏，之后血红蛋白就地分解代谢。多为先天性，呈慢性发作。患者常有脾大。,5,3.按溶血发生的急慢分类,急性溶血：起病急，有发热及全身症状。重者可发生休克、急性肾功能衰竭。红细胞及血红蛋白急剧下降，出现血红蛋白血症和血红蛋白尿症。发作12小时后可发生黄疸。慢性溶血：起病缓慢。除可代偿者无明显表现外，常出现贫血、黄疸和脾肿大。,6,一、溶血性贫血的筛查试验：,（一）血浆游离血红蛋白测定参考值50mg/L(1-5mg/dL)临床意义血管内溶血时血浆游离血红蛋白明显升高。血管外溶血时正常。自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻度升高。,7,一、溶血性贫血的筛查试验：,（二）血浆结合珠蛋白：（Hp）参考值0.7-1.5g/L(70-150mg/dL)临床意义减低：见于各种溶血时，以血管内溶血减低为显著。肝脏疾病、传单、先天性无结合珠蛋白血症。增高：见于感染、创伤、恶性肿瘤、SLE、糖皮质激素、口服避孕药、肝外阻塞性黄疸。,8,一、溶血性贫血的筛查试验,（三）血浆高铁血红素清蛋白测定正常值 阴性临床意义 阳性表示为严重血管内溶血（四）红细胞寿命测定用51Cr标记红细胞检测红细胞半衰期。正常红细胞半衰期为25-32天。溶血性贫血时常小于15天。这是确定溶血性贫血的可靠方法。,9,一、溶血性贫血的筛查试验,（五）尿含铁血黄素试验（Rous试验）原理铁离子在酸化的低铁氰化钾溶液中生成蓝色的铁氰化钾，即普鲁士兰反应。如尿液中脱落的肾小管上皮细胞有含铁血黄素，显微镜下观察可有深蓝色物质出现，即为阳性。正常值 阴性临床意义 慢性血管内溶血可呈阳性，并持续数周。常见于PNH。在溶血初期可呈阴性。,10,二、红细胞膜缺陷的检测,（一）红细胞渗透脆性试验原理 红细胞在低渗氯化钠溶液中细胞逐渐膨胀甚至破裂而溶血。该试验是测定红细胞对不同浓度低渗氯化钠溶血的抵抗力，即红细胞渗透脆性。将患者的红细胞加至按比例配置的不同浓度低渗氯化钠溶液中观察其溶血的情况，结果以被检红细胞最小抵抗力（开始溶血时氯化钠溶液的浓度）和最大抵抗力（完全溶血时氯化钠溶液的浓度）来表示。参考值 开始溶血：0.42-0.46%（4.2-4.6g/L）NaCl溶液 完全溶血： 0.28-0.34%（2.8-3.4g/L）NaCl溶液临床意义脆性增高：见于遗传性球形细胞增多症，温抗体型自身免疫溶血性贫血、遗传性椭圆型细胞增多症脆性减低：见于海洋性贫血、缺铁性贫血、某些肝硬化和阻塞性黄疸等。,11,二、红细胞膜缺陷的检测,（二）红细胞孵育渗透脆性试验原理 红细胞孵育过程中，葡萄糖的消耗增加，储备的ATP减少，导致红细胞膜对阳离子的主动传递受阻，钠离子在红细胞内集聚，细胞膨胀，渗透脆性增加。参考值未孵育：50%溶血为4.00-4.45g/LNaCl37孵育24小时：50%溶血为4.65-5.9g/LNaCl临床意义常用于轻型遗传性球形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血的诊断和鉴别诊断。脆性增高：见于遗传性球形细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血。脆性减低：见于珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、廉状细胞贫血、脾切除术后。,12,二、红细胞膜缺陷的检测,（三）自身溶血试验及其纠正试验原理先天性非球形细胞溶血性贫血患者，由于红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，不能提供足量ATP,以维持红细胞内的钠泵作用。患者红细胞无菌条件下在自身血浆中温育48小时，使ATP储备减少，钠泵作用减弱，导致溶血增强。在孵育过程中，分别加入葡萄糖及加入ATP作为纠正物，并以氯化钠溶液为对照，观察溶血是否能被纠正。参考值正常人红细胞经孵育48h后，仅轻微溶血、溶血度3.5%;加入葡萄糖及ATP孵育，溶血明显纠正，溶血度均75%; 高铁血红蛋白 0.3-1.3g/L临床意义减低：蚕豆病和伯氨喹型药物溶血性贫血患者由于G6PD缺陷，高铁血红蛋白还原率明显下降。,14,三、红细胞酶缺陷的检测,（二）氰化物-抗坏血酸试验 原理抗坏血酸与HbO2反应，氰化钠能抑制过氧化氢酶以使H2O2不受影响，从而使H2O2与还原型谷胱甘肽（GSH)发生反应，产生氧化型谷胱甘肽（GSSG)，后者需要NADPH使其再还原为GSH。如红细胞中催化NADPH形成的酶（如G6PD)缺乏，则GSH产生减少，使H2O2蓄积， HbO2 被氧化成为棕色的高铁血红蛋白。如红细胞不缺乏G6PD则GSH活性正常， HbO2即被还原失效， HbO2仍呈鲜红色。临床意义正常血液要在几小时以后才变成暗色。纯合子G6PD缺乏的血液变成棕色（巧克力色），在2h内即变色，杂合子者要3-4h变色。,15,三、红细胞酶缺陷的检测,（三）变形珠蛋白小体生成试验原理 G6PD缺乏可致红细胞内的还原型谷胱甘肽含量减少，随之出现高铁血红蛋白增高。最后形成变性珠蛋白小体（Heinz bodies)。取G6PD缺陷者血液，然后加乙酰苯肼于被检血样及对照标本中，37温育2-4h，推薄血片，用1%煌焦油蓝染色。计算含5个或更多珠蛋白小体的红细胞比率。参考值 参考值30%临床意义G6PD缺陷症，不稳定Hb、HbH病等常高于45%,16,三、红细胞酶缺陷的检测,（四）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定原理在G6PD和NADP存在下，G6PD能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成NADPH的量来测定G6PD活性。参考值 正常人有甚强荧光。正常人酶活性为（4.971.43）U/gHb临床意义G6PD缺陷症荧光很弱或无荧光；杂合子或某些G6PD变异体则可能有轻到中度荧光。,17,三、红细胞酶缺陷的检测,（五）丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定原理 在二磷酸腺苷（ADP）存在条件下，丙酮酸激酶催化烯醇式磷酸丙酮酸变为丙酮酸，在辅酶还原型（NADH）存在情况下，丙酮酸被乳酸脱氢酶作用转变成乳酸，若荧光标记于NADH上此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD。参考值 正常丙酮酸激酶（PK）活性荧光在20分钟内消失。酶活性（15.14.99）U/gHb临床意义PK严重缺乏（纯合子）荧光60分钟不消失；杂合子者荧光25-60分钟消失。,18,四、珠蛋白生成异常的检测,(一)血红蛋白电泳原理 基本原理与血清蛋白电泳相同。参考值正常人的电泳图谱显示4条区带，最靠阳极端的为量多的HbA, 其后为量少的HbA2,再后两条量更少的红细胞内的非血红蛋白成分（NH1和NH2）。,临床意义 HBA2增高：是诊断轻型地中海贫血的重要依据。 HBA2减低：见于缺铁性贫血及铁粒幼细胞贫血。,19,20,四、珠蛋白生成异常的检测,（二）胎儿血红蛋白酸洗脱试验原理 HbF抗酸能力较HbA强。因此，经固定后的血片，置酸性缓冲液中保湿一定时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色而呈鲜红色。参考值脐带血、新生儿、婴儿阳性，成人1%。临床意义地中海贫血患者轻型者（杂合子）仅少数红细胞呈阳性，重型者阳性红细胞明显增多。,21,四、珠蛋白生成异常的检测,（三）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验原理 在碱性溶液中， HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性被沉淀。测定其滤液中Hb含量，即HbF含量。参考值成人2%。新生儿55-85%，1岁左右同成人。临床意义增高：地中海贫血明显增高，重型者高达80-90%。急性白血病、再生障碍性贫血、红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。,22,四、珠蛋白生成异常的检测,（四）HbA2定量测定参考值1.1-3.2%。临床意义 同血红蛋白电泳。（五）限制性内切酶谱分析根据患者DNA限制性内切酶图谱的变化或限制性内切酶降解DNA片段长度的多态性，来分析是否存在珠蛋白基因的突变、缺失等缺陷，为Hb病的基因诊断。 此外，还有其他检测方法：异丙醇试验、热变性试验、血红蛋白H 包涵体检查、红细胞镰变(HbS) 试验、HbS 溶解度试验、血红蛋白C 试验等。,23,五、自身免疫性溶血性贫血检测,自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA）系体内免疫反应发生变异，产生自身抗体或（和）补体，结合在红细胞膜上，使红细胞破坏加速而引起的一组溶血性贫血。,24,五、自身免疫性溶血性贫血检测,（一）抗人球蛋白试验（Coombs test)原理不完全抗体无法架接两个相邻的红细胞，而只能和一个红细胞表面抗原结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体，可与多个不完全抗体的Fc段结合，导致红细胞产生凝集，称为抗人球蛋白试验阳性。直接抗人球蛋白试验阳性说明病人红细胞表面上包被有不完全抗体，而间接抗人球蛋白试验阳性说明患者血清中含有不完全抗体。【参考值】直接、间接法均呈阴性反应。,25,26,五、自身免疫性溶血性贫血检测,（一）抗人球蛋白试验（Coombs test)临床意义1、阳性 见于新生儿溶血病、AIHA、SLE、RF、恶性淋巴瘤、甲基多巴等药物性溶血反应。2、AIHA大多属于温抗体型（即于37条件下作用最强，主要为IgG),但也有小部分属冷抗体型（IgM）,必要时应用于4 条件下进行试验，排除假阴性反应。3、AIHA大多为IgG型抗体，也有少数IgG亚型、IgA、IgM型，应使用广谱的抗人球蛋白血清进行试验，以提高检出阳性率。4、间接Coombs 试验 主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测。很少用于AIHA诊断。,27,五、自身免疫性溶血性贫血检测,（二）冷凝集素试验原理 冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身红细胞、“O”型红细胞或与患者同型红细胞发生凝集，当温度增高时，凝集块又复消失。参考值效价1:40,反应最适温度为4。临床意义某些AIHA患者的冷凝集素效价很高，有的可达64000或更高。,28,五、自身免疫性溶血性贫血检测,（三）冷热双相溶血试验原理 阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）患者的血清中有双相溶血素，在0-4 时，溶血素与红细胞结合，并吸附补体，但不溶血；当升温至30-37 则发生溶血。参考值阴性。临床意义阳性见于PCH。某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、传染性单核细胞增多症也可有阳性反应。,29,六、阵发性睡眠型血红蛋白尿检测,PNH为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血，常在睡眠时加重，可伴发作性血红蛋白尿和全血细胞减少症。（一）酸化溶血试验原理又称Ham试验。PNH患者的红细胞对补体敏感性增高，在酸化的血清中（pH6.6-6.8），经37 孵育，易溶血。参考值阴性临床意义阳性见于PNH, 某些AIHA发作时也可阳性。,30,六、阵发性睡眠型血红蛋白尿检测,（二）蔗糖溶血试验原理蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与红细胞膜的结合，使PNH患者的红细胞膜上形成小孔，遂使蔗糖进入红细胞而导致溶血。参考值阴性临床意义PNH常为阳性。也可见于巨幼细胞贫血、AA、AIHA和遗传性球形细胞增多症。可作为PNH的筛选试验，阴性可排除PNH, 阳性应再做Ham试验。（三）蛇毒因子溶血试验蛇毒因子是以眼镜蛇毒中提取的一种分子量为144000蛋白质，能直接激活血清中的补体C3，通过旁路途径激活补体系统，进攻PNH红细胞，造成溶血。本试验为特异性PNH试验。CD55和CD59阴性的红细胞和中性粒细胞检测,31,溶血性贫血的实验诊断步骤,确定是否为溶血病史贫血？黄疸？网织红细胞计数？查找溶血原因年龄、种族、职业、饮食、药物史、家族遗传史等,32,第四节 血型鉴定与交叉配血试验,33,血型（blood group）是人体血液的一种遗传性状，各种血液成分包括红细胞、白细胞、血小板及某些血浆蛋白在个体之间均具有抗原成分的差异，受独立的遗传基因控制。由若干个相互关联的抗原抗体组成的血型体系，称为血型系统。血型血清学的研究尤其在输血、器官移植、骨髓移植等临床实践中发挥着重要作用。,34,一、红细胞血型系统,已经发现并为国际输血协会承认的血型系统有30种，包括超过400种抗原，其中大部分都非常罕见，最重要的两种为“ABO血型系统”和“Rh血型系统”。血型系统对输血具有重要意义，以不相容的血型输血可能导致溶血反应的发生，造成溶血性贫血、肾衰竭、休克以至死亡。,35,血型分类的依据是红细胞表面是否存在某些可遗传的抗原物质。红细胞凝集Agglutination：血型不相容的血液混合后，其中的红细胞聚集成簇并溶血。,36,37,造成凝集的机制是抗原-抗体反应红细胞表面上含有的特异性糖蛋白抗原物质统称为 凝集原Agglutinogen。在血浆中则含有与之相应的特异性抗 体，称为凝集素Agglutinin。,38,（一）ABO血型系统,1901年Landsteiner首先发现1、血型系统的抗原和抗体：根据红细胞表面是否具有A或B抗原，血清中是否存在抗A或B抗体，将ABO血型系统分为四型,39,40,（一）ABO血型系统,2、ABO血型的亚型ABO血型系统中重要的亚型是A亚型A亚型：主要有A1和A2。A1亚型的红细胞上具有A1和A2抗原，其血清中含有抗B抗体。A2亚型的红细胞上只有A抗原，其血清中除含有抗B抗体外，可有少量的抗A1抗体。B亚型：不多见，抗原性很弱，临床意义不大。,41,（一）ABO血型系统,3、ABO血型鉴定和交叉配血试验（1）ABO血型鉴定ABO血型抗体能在生理盐水中与相应红细胞抗原结合而发生凝集反应。采用标准的抗A及抗B血清以鉴定被检者红细胞上的抗原（Beth-Vincent 直接试验），同时用标准的A型及B红细胞鉴定被检者血清中的抗体（Simonin 反转试验）。只有被检者红细胞上的抗原鉴定和血清中的抗体鉴定所得结果完全相符时才能肯定其血型类别。,42,用标准血清及标准红细胞鉴定ABO血型结果,43,（一）ABO血型系统,（2）交叉配血试验采用试管法。主试验：受血者血清供血者红细胞悬液副试验：供血者血清受血者红细胞悬液结果判断：同型血之间作交叉配血时，主侧管均无凝集反应，表示配血完全相合。,44,（一）ABO血型系统,4、ABO血型系统的临床意义溶血性输血反应误输ABO血型不合的血:严重的溶血反应，危及生命。O型血作为“万能血”输入：紧急情况下才考虑。AB型病人输入非同型血：也可引起溶血反应。A1B型：抗O抗体A2B型：抗A1抗体新生儿溶血症: 母子血型不符。O型母亲发病率高，可能与其在受到A或B型抗原物质免疫后产生的免疫性抗体效价较高有关。ABO血型与器官移植 血型不符易失败 肾46%其他：用于亲缘鉴定，某些疾病相关性的调查等。,45,附：血型的遗传规律,46,（一）ABO血型系统,（二）Rh血型系统Rh血型系统是将恒河猴(Rhesus monkey)的红细胞免疫豚鼠和家兔,所得到抗血清能与人的红细胞发生凝集反应,证明人与恒河猴红细胞具有同一抗原,取Rhesus头两字母称Rh血型系统。汉人约99%、白人约85Rh阳性。临床意义：溶血性输血反应 Rh- 受血者 + Rh+ 供血者,第二次受血溶血新生儿溶血症 母Rh- + 子Rh+, 溶血,47,Rh血型的临床意义,新生儿溶血,48,分娩后72h内进行Rh抗体被动免疫,胎儿红细胞进入母体即被破坏 （不能诱导母亲抗Rh免疫反应）,Rh+,Rh,初孕,健康新生儿,健康新生儿,新生儿溶血的预防,49,二、其他血型系统1白细胞抗原系统： WBC自身特有的抗原、HLA抗原HLA抗原：人类白细胞抗原 组织相容性抗原 临床应用：1）器官移植前的HLA检测：提高成功率。 2）亲子鉴定：父母各一个单倍体 型构成子代基因型。,50,2血小板抗原及抗体： （1）血小板抗原 （2）血小板抗体 原发：ITP 继发：输血、输BPC、妊娠时。,3血清蛋白成分的抗原特异性： 由遗传基因不同造成。 免疫蛋白、白