植物细胞培养及次生物质生产课件

植物细胞培养,是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。,细胞培养与组织培养的区别,1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。,细胞培养培养类型,根据培养规模：小规模和大批量培养根据培养方式：悬浮、平板、看护培养根据要求产物：用于诱变和生产次生(级)产物(Secondary products)的细胞培养,悬浮培养单细胞培养细胞规模化培养培养细胞的次级代谢及产物积累,悬浮培养（Suspension culture）,悬浮培养 是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。,细胞悬浮培养的应用,Suspension cells,Plants,Artificial seeds,Isolation protoplasts,Mutation select,Secondary products,细胞悬浮培养的建立,愈伤组织的诱导,悬浮系的建立与继代培养,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞同步化,愈伤组织的诱导,选择适宜的外植体：幼胚下胚轴子叶选择适宜的培养基：MS，B5，N6较高激素浓度必要的附加物质,要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎,适宜悬浮培养,适宜再生植株,悬浮系的建立与培养,callus,150250ml flask,centrifuge isolation,subculture,1g/10ml medium,100120 rmp culture transfer 1 time/3d,80 rpm,成功的悬浮细胞培养体系特征,悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天便可增加一倍。,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞生长的衡量,根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值p(lnx-lnx0)/t鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量,影响悬浮细胞生长的因素,起始愈伤组织的质量接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.52.5105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。,影响悬浮细胞生长的因素,培养基应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基设计时，一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。植物激素和其他附加成分的应用。,影响悬浮细胞生长的因素,培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养温度 25继代周期指具有一定起始密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。,悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。 什么措施？,细胞周期,饥饿法,饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。,抑制剂法,通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。,分选法,依据：细胞体积大小方法常规分选方法是梯度离心精细的分选可采用流式细胞仪优点操作简单分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用缺点分选精细度较差,低温处理,可以提高培养体系中细胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。梅兴国等（2001）采用6低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。可能的原因不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。,单细胞培养,意义分离方法培养方法,植物单细胞培养的意义,建立单细胞无性系，有助于研究植物细胞的特性和潜力，了解细胞间的相互关系，研究细胞分化、发育和形态发生的分子机理。采用生物化学的方法，对培养的单细胞进行人工诱发突变，或建立遗传转化受体。在细胞水平上对花粉进行培养，可排除体细胞干扰。利用生物反应器可大规模地培养细胞，进行次生代谢产物的生产。,单细胞分离方法,机械法具体做法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。,单细胞分离方法,酶解法酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。(纤维素酶，果胶酶)优点可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。,细胞悬浮,过滤,与培养基混合,植板,培养,克隆愈伤组织,细胞平板培养 (plating culture),指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5103个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。,细胞平板培养（plating culture),平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 每个平板形成的细胞团数植板率 每个平板接种的细胞总数,细胞平板培养 (plating culture),优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,看护培养（nurse culture）,Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,微室培养(microchamber culture),在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。细胞起始密度：3080个/室。,双层滤纸植板培养,Horsch等（1980）建立,培养皿,培养基,饲养细胞层,培养细胞,看护滤纸,转移滤纸,植物细胞规模化培养,意义规模化培养体系的建立生 物 反 应 器规模化培养的技术问题,意义,应用培养细胞系统合成有用的天然产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。目前有约25的法定药品来自植物，其有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品,部分代表性植物次生产物及其植物资源,植物细胞大规模培养的技术要求,从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中,植物细胞规模化培养体系的建立,种子细胞选择外植体高产细胞种子细胞增殖与放大培养大规模培养体系建立,种子细胞选择,外植体选择植物类型：遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及品种或单株。组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官的特异性，因此，在起始细胞培养时尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织作为外植体。,种子细胞选择,高产细胞系的筛选悬浮细胞系单细胞克隆种细胞增殖,种子细胞选择,直选法李志勇等（2002）直接从起始细胞中挑选不同细胞团建立了10个大蒜细胞悬浮系，比较研究显示，不同悬浮细胞系的SOD合成能力最大差异可达5倍。适当增加选择压力，采用一些诱变的方法梅兴国（2001）通过在培养基中添加1.6mM的L-Phe，筛选出了抗Phe的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞35倍。,种子细胞增殖与放大培养,目的准备材料提供技术参数过程摇瓶反应器,大规模培养体系的建立,培养方式成批培养、半连续培养和连续培养。培养方式的选择根据次生产物积累而定，通常还根据不同要求进行改进。当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，就需要采用两步法培养，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，将其转至产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。,生物反应器类型及特点,是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。搅拌式气动式固定化式其它光照生物反应器，转鼓式,植物细胞培养生物反应器,搅拌式反应器,气动式反应器,又称空气提升式反应器特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。,Flash,固定化反应器,种类：包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。Alfermann等(1983)用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用30 L和200 L的反应器生产地高辛。Jose等(1983)进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质,Flash,规模化培养中有关工程技术问题,悬浮培养系统必须适应植物细胞特性细胞体积大。其平均直径比细菌大几十倍通常以2200个细胞，直径2mm大小的非均匀小细胞团形式存在。抗剪切能力弱。生长速度慢，周期长，培养基成分复杂，有利于微生物生长，因此在培养中维持无菌环境难度较大但又十分重要。,规模化培养中有关工程技术问题,培养液的流变特性粘度变化原因：细胞密度和细胞状态的变化细胞密度：当低于7g/L时(烟草细胞)，培养液粘度基本不变，而高于此值时，粘度增加。细胞状态：培养密度在10g/L时，大细胞团(长春花细胞)的营养液表观粘度明显大于小细胞团的表观粘度。,规模化培养中有关工程技术问题,氧气含量调节KLa（氧的传递系数， Nv=Kla(C*-C) ）：如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，KLa在20h-1左右时。细胞生长与次生产物合成维持在良好状态；在15L通风式反应器中培养的烟草细胞，当KLa在510h-1的范围内，生物量和代谢产物随KLa增加而增加。溶氧浓度：毛地黄细胞培养，当培养基氧浓度从10饱和度上升至30，细胞生长速率从0.15d-1上升至0.20d-1，如果继续上升至 40，细胞生长速率反而下降至0.17d-1。,规模化培养中有关工程技术问题,CO2调节在通气过程中，混入24的CO2能消除高通气速率对长春花细胞生长和次生代谢产物合成的不利影响。,规模化培养中有关工程技术问题,泡沫和表面黏附性植物细胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率。消除方法化学消泡：天然油脂、高级醇类、聚醚类机械消泡,规模化培养中有关工程技术问题,剪切力对植物细胞的影响适当的剪切力可以增加培养系统的通气性保持良好的混合状态和分散性提高细胞生物量和次生产物量过高的剪切力导致细胞团变小、细胞破损来源搅拌桨形式、搅拌速度、通气速率,培养细胞的次生代谢及产物积累,植物次生代谢（secondary metabolism）1891年由Kossel提出，非细胞生命活动所必需。植物次生代谢产物(secondary metabolites) 的类型培养下的植物细胞次生代谢产物积累特性提高细胞次生产物量的途径,植物次生产物的主要类型,酚类化合物黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类：结构： C6-C3-C6生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。功效：为治理心血管疾病和高血压的药物成分。醌类化合物：结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物，种类：苯醌、萘醌。功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。,萜类化合物,组成单元：异戊二烯合成途径：异戊二烯途径种类：单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。萜类化合物已超过2万种。单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值。倍半萜：抗疟疾药物青蒿素。二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。三萜皂甙：人参皂甙。甾体皂甙：薯蓣皂甙。,含氮化合物,包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷种类：5500种以上分布：双子叶植物生物碱的作用：药用，植物抗毒素。目前对生物合成途径研究比较清楚的有：烟草的烟碱(nicotine)、毒藜碱(anabasine) 和吡咯生物碱(pyrrolizidine alkaloid)，毛茛科植物的小檗碱(berberine) ，曼陀罗属植物的莨菪碱(tropine)和东莨菪碱(scopolamine) 。,培养条件下植物细胞次生产物积累的特性,生长偶联型产物合成与细胞生长成正比，如长春花中长春花碱的合成、烟草细胞烟碱合成、薯蓣中薯蓣皂甙的合成。中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成，蒽醌类物质合成的植物细胞、莨菪烷类合成的植物细胞等属于此类型。非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁。,提高细胞次生产物产量的途径,选择适宜的起始材料种类、部位栀子（Gardenia jasminoides）胚轴 银杏子叶 当归根 红豆杉 幼嫩的茎茜草 叶柄,培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。,提高细胞次生产物产量的途径,前体（precursor）的应用作用：提高目的产物产量。选择对某一目的产物来讲可能有多种前体物质同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。多数前体物质对细胞生长本身并不十分有力注意前体浓度。过量也可能产生反馈抑制。,人参皂甙的生物合成途径乙酰辅酶A 甲羟戊酸（MVA）反式角鲨烯（C30） 2,3-氧化鲨烯 环阿屯醇 达玛烯二醇 香树素植物甾醇 人参皂甙Rg1 人参皂甙Ro,提高细胞次生产物产量的途径,激发子（elicitor）的应用也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子。非生物激发子，如辐射、金属离子、茉莉酸类似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激发子外源激发子：菌丝、微生物机体提取物及微生物产生的多糖、蛋白和脂肪酸等内源性激发子：来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。,提高细胞次生产物产量的途径,激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关激发子对南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇的影响,M-JAMg/L,0.0,0.1,10.0,1.0,提高细胞次生产物产量的途径,培养技术的选择包括反应器的选择和培养方式的选择培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本。,提高细胞次生产物产量的途径,两相培养(twophase culture)指在植物细胞培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外，并被另一相所吸附。,两相培养,组成：培养相和提取相组成类型：液-液系统和液-固系统液-液系统：分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物。分离相和培养基的化学性质和比重不同。液-固系统：是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂。,红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇,实验材料：东北红豆杉细胞系培养基：第一相：B5培养基，第二相：5(v/v)的松油醇，产物释放剂：5(v/v)二甲基亚砜。接种量:10g (鲜重)/100ml培养基/250mL 三角烧瓶。培养条件：25，120rpm，黑暗培养。,细胞干重；紫杉醇产量；两相系统 ；单相系统,第二相的加入，使得紫杉醇产量提高到30.19mg/L，比对照增加103%；63的紫杉醇从胞内的释放出来，其中有75转移至有机相。,提高细胞次生产物产量的途径,两步培养在生长培养基中培养细胞在生产培养基中积累产物,提高细胞次生产物产量的途径,器官组织在反应器中的培养技术发状根（毛状根，hairy root）培养生产次生产物，已在人参、丹参、紫草、颠茄和黄芪等植物中进行了探索性研究，并取得良好进展。冠瘿组织培养用于次生产物的生产。,毛状根,毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。,1934年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根,农杆菌附着在植物细胞表面,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,青蒿：为双子叶植物药菊科植物青蒿素：,倍半萜内酯类化合物功效：治疗疟疾,1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebulizing device, 15. 40W fluorescent lamp,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in th