维持胚胎干细胞多能性与诱导定向分化

,干细胞与再生医学,姓名：张鑫学号：2120161211专业：病理学与病理生理学导师：李宗金,2016.12.15,维持胚胎干细胞的多能性及诱导定向分化,ES 细胞多能性相关重要信号通路小分子化合物在ES细胞中的应用,ES 细胞在生物医学领域的应用取决于能否自由操纵 ES 细胞的命运。 ES 细胞有许多重要的内源转录因子可以决定其命运，如果不采用基因操作的手段很难控制这些转录因子的内源水平。为此目前研究主要选择改变体外培养条件来控制 ES细胞自我更新或者步入分化的命运。所以，鉴定能够决定 ES 细胞命运的信号通路以及下游的靶标蛋白具有十分重要的意义。,ES 细胞多能性相关重要信号通路,NO.1,LIF/JAK/STAT3 signaling pathway,体外培养小鼠 ES 细胞需要和灭活的成纤维细胞滋养层共培养白血病抑制因子（LIF）撤掉 LIF 致使 ES细胞迅速分化为中胚层和内胚层的混合细胞群,STAT3 下游靶标基因 关键多能性因子的有力候选基因,直接调控转录因子 Myc持续表达自我更新不再依赖 LIF,下 游 靶 标 包 含 Klf4 ,Pim1/3 ,Prr13,Gbx2,Pramel7,Pem/Rhox5,Jmjd1a 以及 Tfcp2l1,过表达模拟 LIF 的功效,分离处于原始多能性状态的人类 ES 细胞，这些细胞具有较高的 LIF/STAT3 活性，这证明了 LIF/STAT3 是原始多能性的强力标志。Tfcp2l1在人类囊胚的内细胞团中高水平表达，而从内细胞团分离的人 ES 细胞内，Tfcp2l1 的表达却显著下降，而其表达水平在重建原始多能性的过程中又明显上调。敲降Tfcp2l1 的人类多能性干细胞无法完成向原始多能性的转化。Tfcp2l1 可能是 LIF/STAT3 通路下游建立和维持原始 多能性的重要的效应蛋白。,Wnt/-catenin signaling pathway,基于N2B27 的化学成分明 确的培养体系糖原合成激酶 3（GSK3）的抑制剂 CHIR99021（CHIR）,CHIR 不能维持 -catenin 敲除的 ES 细胞自我更新，提示着-catenin 在这一过程中发挥关键的作用。,TGF-/SMAD signaling pathway,TGF- 生 长 因 子 超 家 族 可 以 分 为 两 个 亚 组 ： TGF-/Activin/Nodal 通 路 和BMP/Smad/Id 通路。TGF- 超家族执行着进化保守的功能，包括胚胎形态发生，细胞命运选择，细胞增殖，分化和凋亡。 两个信号通路分别是被配体结合穿膜的型和型受体启动，型受体的胞内结构域通过然后丝氨酸/苏氨酸激酶活性磷酸化 TGF- 通路的效应蛋白SMAD 蛋白（SMAD1，2，3，5，8）。磷酸化的 SMAD蛋白进行同源三聚化并和 SMAD4 形成异源复合物。激活的 SMAD 复合物易位进入核内，识别特定的 DNA 序列启动对靶基因的转录调控。TGF-/Activin/Nodal 通路对上皮样细胞-间充质干细胞转化（EMT）过程至关重要，EMT 是胚胎发育的重要标志。,在有血清无滋养层的条件下，BMP 通路可以协同 LIF/STAT3 通路维持小鼠 ES 细胞的自我更新。激活的 LIF/STAT3 主要抑制朝向中胚层和内胚层的分化，而 BMPs 主要通过 SMAD1/5/8 抑制朝向神经系统的分化。,NO.2,小分子化合物在ES细胞中的应用,干细胞生物学，尤其是 iPS 技术的发展为 ES 细胞在再生医学上的应用提供了强大的理论基础，同时也要求研究者们对 ES 细胞的维持及定向分化有更为深入的了解。现已证明，靶向特定信号通路或机制的小分子化合物在控制细胞命运，状态和功能方面有重要作用。这些小分子将对阐释 ES 细胞生物学功能和促进其在再生医学中的应用发挥越来越重要的作用。 维持 ES 细胞多能性，或诱导 ES细胞分化方面的取得一定研究进展的小分子化合物SC1，CHIR99021，PD0325901，SB431542以及BIO 。, SC1 能够在无滋养层，无血清且无 LIF 添加的细胞培养液中使小鼠 ES 细胞保持未分化的多能性状态。长期添加 SC1 的 ES 细胞能够在体外分化为所有三个胚层的细胞，并且能生成嵌合小鼠。化学和生物学的实验表明SC1 是通过抑制 RsaGAP 和细胞外信号调节激酶 （ERK1）而发挥作用的。RasGAP 的抑制能够增强磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）信号从而促进 ES 细胞的自我更新，同时 ERK1 的抑制还能够抑制 ES 细胞的分化。,CHIR99021 是糖原合酶激酶-3（GSK3）的特异性抑制剂，该通路的抑制会激活 Wnt 通路，从而促进细胞的自我更新。 PD0325901 是丝裂原活化蛋白激酶（MEK）的抑制剂，这一抑制作用阻止了 ES 细胞的分化。 同时添加这两种小分子能够在没有外源细胞因子添加的情况下促进小鼠ES细胞的分离和长期的自我更新。,SB431542 是 TGF- 受体的抑制剂，在其它细胞添加剂存在的条件下，Noggin（一个可以结合并抑制 BMP4 的分泌蛋白）与 SB431542 的加入能够共同诱导大于 80%的人类 ES 细胞向神经细胞分化。 这两个通路抑制剂协同作用会影响人类 ES 细胞的自我更新（因为 TGF- 信号通路是人类 ES 细胞维持自我更新所必需的），并阻止细胞分化为滋养外胚层，中胚层和内胚层的细胞。,BIO 是 Wnt 通路的激活剂，通过特异性的抑制 GSK-3 来维持人类和小鼠 ES 细胞的多能性和维持多能性特异性转录因子 Oct4，Rex-1 和 Nanog 的表达。 Wnt通路在未分化的小鼠 ES 细胞中自发激活并在分化过程中活性下降。同其它小分子一样，BIO 介导的 Wnt 通路的激活是可逆的，当其被撤掉后，ES 细胞就可以进行正常的多向分化。小分子的这些特性也使它们更加有望用于再生医学中。,除此之外：,干细胞的定向分化是生物体发育、生长和修复的基础,小分子化合物由于其显著的优势越来越多地被应用于体外诱导干细胞定向分化和疾病的治疗。,用视黄酸处理的鼠胚胎干细胞会分化为神经祖细胞, 再经过 Shh 的特异性小分子拮抗剂 Hh -Ag1 .3处理 , 则定向分化为运动神经元。 PI3 -K 抑制剂 LY294002 能促使体外培养的胚胎干细胞分化为分泌胰岛素的 细胞。 抗坏血酸能有效地加强胚胎干细胞向心肌细胞分化。,骨髓基质干细胞(MSCs)在地塞米松、8 -甘油磷酸钠 、维生素 C 的诱导作用下 , 能够向成骨细胞分化 小分子化合物 D609 ， -巯基乙醇(BME)、二甲基亚砜(DMSO)和丁羟基茴香醚(BHA)等能诱导MSCs 向神经元样细胞分化还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。 由于其来源广泛取材方便, 以及移植时发生免疫排斥反应的程度较低 ,因而是目前临床应用前景较好的细胞替代治疗的靶细胞。,神经干细胞(NSCs)是指具