第八章病毒学研究方法简介

第八章第八章 病毒学研究方法简介病毒学研究方法简介生物安全实验室 P1实验室 研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； P2实验室 研究的是中度危险的病原，像 肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩； P3实验室 研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比 P1/P2实验室严密得多； P4实验室 全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的 埃博拉病毒、马尔堡病毒 ，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。 病毒学研究的主要方法生物学特性测定 :在寄主上的反应 症状、传播 等病毒分离与培养 ：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察 ： 病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况免疫学技术 ： 以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术 ： 核酸分子杂交、 PCR等一、生物学特性测定 在寄主上的反应寄主范围、症状表现、传播方式 等 病毒的理化性质病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、 体外存活期等 病毒接种方法注射接种、病毒组织培养技术植物病毒 汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁 接接种、菟丝子接种法等巨细胞病毒感染细胞的典型 “猫头鹰眼 ”样核内包涵体冠状病毒感染 “ 非典 ”X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。 TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)腿色斑 Chlorotic spoting 黄化 Yellowing病毒检测斑驳 Mottle 脉明症 Vein-clearing条斑 Leaf streak腿色斑驳 Chlorotic mottle yellow dwarf变色变色seed coat mottling 郁金香碎锦花叶病 花变色 碎色症 color breaking、花瓣变绿 virescence杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰、虞美人、唐菖蒲 Testing for Soybean Viruses with Indicator Plants Hypersensitivity Some plants are predictably sensitive to a specific virus. The hypersensitive plants are called indicator plants, and are used as a bioassay to test for the presence of virus in an unknown sample 1 Materials : gloves, sterile cotton swabs, rinse bottle, tissue grinding bags and carborundum - silicon carbide which is used as a tissue abrasive2Plant sap is made from the plant to be tested for virus by pulling off a symptomatic upper leaf3 placing the leaf in a sterile plastic bag. adding buffer solution to the bag. grind the leaf tissue to release the virus particles into the buffer. 4 sprinkle a bit of carborundum on the plant to be inoculated. Just a light dusting is sufficient to provide enough abrasion to introduce virus into the plant cells. 5 inoculate the indicator plant, a cotton swab is immersed in plant sap rub the surface of the test plant leaf firmly, but not with enough force to tear the leaf 67 rinse off the carborundum excess sap from the leaf with water to remove compounds that could interfere with the infection process 8 The indicator plants are placed in the greenhouse and checked daily for symptoms. If characteristic symptoms appear, we know that virus particles were present 卵黄囊接种： 用 58d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔： 用 1214d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔： 用 912d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒膜尿囊膜： 用 1012d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病 变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒鸡胚接种绒毛尿囊膜衰现痘病毒特异性损伤要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满足 Rivers法则： 从患病者体内分离出病毒； 在实验动物或寄主细胞中可以培养； 证明这种培养物具有滤过性； 在原始宿主或相关种内能产生同样的病症； 能重新分离出病毒。 病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。 病毒分离 (virus isolation)是诊断病毒感染的 “金标准”(goldstandard)。二、病毒的分离与培养标本采集和运送标本采集和运送时间： 发病早期部位： 视发病规律和病程而定运送： 立即送检 4 保存或 -70 （长期保存）不泄漏、传播、填写详细标签分离与鉴定：二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养提纯 extraction/纯化 purification二元培养法（一）病毒的纯化与提纯一般纯化方法 动物病毒的纯化： 从空斑、病斑分离，用终点稀释法 植物病毒的纯化： 如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上； 如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。二、病毒的分离与培养混合感染的病毒分离1、根据病毒的性状、选择 不同的寄主 或根据病毒钝化温度和稀释终点的差异，如：PVX 在千日红上引起局部病斑PVY 在酸浆草上 形成局部病斑，蔓陀罗对 PVY免疫TMV 钝化温度 90 以上CMV钝化温度在 6070 （ 汁液接种前高温处理 .)2、 虫媒传染 ： PVX不可由虫媒传， PVY可由桃蚜 传不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短3、 果树等 木本植物 病毒，如找到 草本寄主 和传毒虫媒可用草本寄主纯化、繁殖、分离二、病毒的分离与培养病毒纯化中的必要参考属性：1. 稀释限点 (dilution end point, DEP)抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度2. 钝化温度 (thermal inactivation point, TIP)病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露 10min而达到完全钝化3. 体外存活期 (L)病毒在抽提液中放在 2022 条件下，能保持多少时间的侵染力。 4. 沉降系数与分子量沉降系数 S在 20 下 1达因的引力场中的沉降的速度（ cm/s) 常用 1000，植物病毒在 50几千 S二、病毒的分离与培养（二）病毒提纯的原理1、破碎寄主细胞低速离心 (100010000g， 515min)去除较大的组分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体 (内质网膜的小碎片 )等较难去除。2、提纯病毒的原理二、病毒的分离与培养（ 1）大多数病毒的外面主要由 蛋白质蛋白质 组成（ 2）病毒的大小、形状和密度适合在大约 40000g重力重力 下沉降常用试剂：1、适当的缓冲剂： 保护病毒，不变性磷酸盐、硼酸盐、 Tris-HCl等（种类、浓度）2、还原剂： 防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶巯基乙醇 / 酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸3、溶剂： 蛋白质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清正丁醇、氯仿、乙醚等4、鳌合剂： EDTA等可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团聚和多元酚氧化5、其他添加剂： 活性碳、膨润土 吸附除去核粒和色素等（三）病毒提纯的技术 二、病毒的分离与培养1、差速离心和密度梯度离心 差速离心： 交替使用高速和低速离心高速离心（ 4000080000g） 使病毒沉淀， 取沉淀低速离心（约 4000g） 仅去除大的细胞碎片等杂质， 取上清 密度梯度离心： 部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离蔗糖 1