第二讲2010基因工程制药1

第二章 基因工程制药Chapter 2 Gene Engineering for Pharmacon 第一节、概述 基因工程 : 是通过对 Nucleic acid 分子的 Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质 （germ plasm） 的重新组合，再借助 Virus ,Bacterium ,Plasmid or other Vectors,将 Target gene转移到新的 Host Cell System,并使 Target Gene在新的 Host cell system 进行 Replication and Expression的技术。 基因工程技术最成功的成就 :用于新型生物技术药物的研制A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求；C、由于免疫抗原 ,病毒感染等缘故，使它们在使用上受到限制。 一、 传统制药存在的问题：1、可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；可避免免疫抗原性及病毒污染（人生长激素 克雅病 CJD）2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；二、基因工程在生物技术制药中的作用4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； IL-2,125半胱氨酸 丝氨 酸提高活性及稳定性；tPA缩小分子延长半衰期5、 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。6、为新药研发提供了新途径和新技术，极大的提高了药物研发速度，缩短药物研发速度。 7、促进传统制药工业的技术改造，为制药工业提供新技术三、基因工程药物发展简史 1976年世界第一家应用 DNA重组技术研究新药的公司美国 Genentech公司成立。 1982年欧洲首先批准 DNA重组的动物疫苗抗球虫病疫苗 1982，美国，英国批准生产和使用了第一个基因工程药物人胰岛素。“ 863” 高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。王大珩中国科学院院士，中国工程院院士，我国应用光学及光学工程的主要奠基人之一。王淦昌中国科学院院士、著名高能物理学家。杨嘉墀中国科学院院士，著名空间自动控制专家。 陈芳允中国科学院院士，著名电子学家 。“十五 ”期间， 863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动化技术、能源技术、资源环境技术等 6个高技术领域 。基因工程药物的种类1、免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体2、细胞因子：干扰素，白介素，集落刺激因子，表皮生长因子及凝血因子。3、激素：胰岛素，心钠素，生长激素。4、酶类：尿激酶，链激酶，葡激酶。基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：上游阶段 ：主要是分离 目的基因 、构建工程菌 (细胞)。目的基因获得后，最主要的就是 目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是 保证表达的蛋白质的功能 ，其次是 表达的量和分离纯化的难易 。 此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段 ：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。四、 基因工程药物生产的基本过程制备基因工程药物的一般程序Get Target GeneConstruction Recombinant PlasmidConstruction Gene Engineering BacteriumCulture Engineering BacteriumSeparate and Purify the ProductsFiltration Bacteria FreeIdentificationSemi-manufactured GoodsIdentificationFinished ProductsMake up or Packaging基因工程药物的上游技术：1、基因克隆载体 :质粒载体，2、重组 DNA技术的有关工具酶及其应用3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体 DNA和待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。1）用碱抽提法分离质粒 DNA原理：细胞 pH12.0-12.6线状 DNA变性， cccDNA不变性，加酸恢复 pH到中性，变性的染色体 DNA交织成网而沉淀，上清用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒 DNA。A）质粒 DNA的小量制备B）质粒 DNA的大量制备 小量制备 大量制备挑单菌落接种在 2ml含抗菌素的 LB中，过夜将 1ml培养物用 0.5ml 水和Solution I 100ul 悬浮Solution II 200ul冰浴裂解Solution III 150ul恢复 pH 酚 /氯仿抽提乙醇沉淀 DNA用 10ml过夜培养物接种 500ml含抗菌素的 LB, 37, 振荡，使OD600为 0.8 1.0。离心回收菌体，用 50ml 水和Solution I 10ml 悬浮，加溶菌酶Solution II 20ml 冰浴裂解Solution III 15ml恢复 pH 上清加 0.6倍异丙醇，得沉淀70乙醇洗 DNA酚 /氯仿抽提乙醇沉淀 DNA2）染色体 DNA的制备3）真核细胞 RNA的制备4) DNA的凝胶 (Agarose)电泳和 凝胶中 DNA的 回收5) SDS-PAGE电泳和 凝胶中 DNA的 回收心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠睾丸 心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠卵巢第二节 目的基因的获得目的基因的获取途径：一、一、 化学合成法二、 逆转录法逆转录法三、三、 RT-PCR法：法：问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？一、化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。 化学合成法有个 先决条件 是 ：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出 DNA的碱基系列。方法 ：合成目的基因 DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的 DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的 DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成基因的 限制 ：a. 不能合成太长的基因。只适用于克隆小分子肽的基因。b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。c. 费用太高。优点 ：可进行密码子的改造一、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 克隆表达。1、 mRNA purification2、合成第一链 cDNA3、 cDNA第二链的合成4、 cDNA cloning：5、将重组体导入 host cell6、 cDNA library identification 7、目的 cDNA 克隆的分离和鉴定1、 mRNA purification 1、 首先必须考虑目的基因 mRNA在特定生物组织中的丰度，一般要选择高丰度 mRNA， 细胞内 RNA的组成和含量 : DNA:95%核内， 5细胞器 RNA： 75细胞质， 10%核内， 15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% 2、但实际操作时多用低丰度 mRNA，为提高文库中目的克隆数目，要采用杂交或体外翻译系统确定 RNA在组织细胞中的含量，以期得到较丰富的起始 mRNA，采用琼脂糖凝胶电泳，非变性蔗糖梯度离心等方法分级收集不同长度mRNA，富集目的序列。 3、抑制 RNA酶活性 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAOligo(dT)纤维素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脱rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纤维素柱纯化 Poly(A)mRNA 流程图真核细胞 mRNA 的特点及分离纯化方法。3-polyA（ 20-250AAA） -oligo(dT)2、合成第一链 cDNA 一次好的逆转录反应可使 oligo(dT)选出的mRNA有 530% 被拷贝。 1、 oligo(dT)引导的 cDNA合成法。缺点是必须从 3端起始，逆转录酶无法到达 mRNA的 5端，对较长的 mRNA难以操作。 2、随机引物引导的 cDNA合成法。根据多种可能的序列合成出 6-10bp的混合物，从多位点同时进行，较易获得特长 mRNA5端的序列53反转录酶（ AMV)553DNApol53加接头并连接到载体筛选重组体并在体外进行表达*随机引物合成 cDNAS1 核酸酶mRNA此法是根据可能的序列合成出 6 10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物）作为合成第一链 cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下， cDNA的合成可以从 mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从 3末端的 oligo(dT)引物一处开始。研究工作证实，对于特长的mRNA分子中的靠近 5端序列，应用这种方法是比较容易得到克隆的。3、 cDNA第二链的合成 1.自我引导合成法：碱水解 mRNA，发卡引 导第二链的合成， S1核酸酶必须是高纯度的，否则由于单链切割作用导致 5端信息丢失，极少采用。 2、 RNaseH降解取代法： 3、外加引物合成法3、合成第二链 cDNA5 帽状结构 PolyA尾巴3polyT反转录酶（ AMV)5 帽状结构 PolyA尾巴3polyT553polyADNApolpolyA53连接到载体筛选重组体并在体外进行表达*置换法合成 cDNAPolyATPolyTmRNA磷酸钠RNase H5 5 55 5RNaseH降解取代法全长 cDNA链的合成5 帽状结构 PolyA尾巴3polyT-限制性内切酶反转录酶（ AMV)5 帽状结构 PolyA尾巴3polyT-限制性内切酶553碱水解法碱解 RNA， 然后末端转移法在 3 加上 polyGpolyT-限制性内切酶3 GGGGG5- 限制性内切酶 -CCCC DNApolpolyT-限制性内切酶3 GGGGG5- 限制性内切酶 -CCCC53酶切并克隆到表达载体筛选重组体并在体外进行表达*引导法合成 cDNA mRNA 外加引物合成法4、 cDNA cloning： 质粒载体： pUC （表达）， pBR322 噬菌体 DNA： gt11表达 gt10 噬菌体大于 10Kb，质粒小于 10Kb大肠杆菌质粒载体 1质粒 pBR322质粒 质粒 pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，亦是应用最为广泛的克隆载体，利用 pBR322曾克隆到多种基因，虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位，但 pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。 pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。 “p”表示它是一种质粒；而 “BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者 F Bo1ivar和 R L Rodriguez姓氏的头一个字母， “322系指实验室编号，以与其他质粒载体如 pBR325， pBR327， pBR328等相区别。第一部分：来源于 pSF2124质粒易位子 Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）；第二部分：来源于 pSC101质粒的四环素抗性基因（ tetr）；第三部分：来源于 ColE1的派生质粒 pMB1的 DNA复制起点（ ori）（ 2） pBR322质粒载体的优点 1、第一个优点是具有较小的分子量 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 3、 具较高的拷贝数 2 pUC质粒载体 pUC载体是在 pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其 5，