细胞培养基本知识

细胞培养2011/11/11申艳娜n 教材 细胞培养 （ Cell culture） 司徒镇强n 任教老师 申艳娜 岳丹 李晓蕾 n 授课 6次理论课 +2次实验课细胞培养n 细胞培养 (cell culture): 动植物细胞在体外培养的条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 n 细胞培养分为动物细胞培养和植物细胞培养，其中动物细胞培养是指在体外无菌条件下，模拟体内正常生理状态下的基本条件和环境，分离培养机体组织细胞或建立细胞系，并使得细胞在体外培养容器中长期生长或繁殖的方法。应用领域广泛n 病毒学n 免疫学n 遗传学n 肿瘤学n 分化及发育n 细胞毒试验n 临床医学及生物技术第一章 细胞培养的基本知识1.掌握培养细胞的生长特点和生长条件。2. 熟悉培养细胞的特性。第二章 细胞培养室的设置、设备和准备工作1.掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。2.掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。3.了解细胞培养实验室的设置。细胞培养的基本知识体外培养细胞的分型 贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：n 成纤维细胞n 上皮型细胞n 游走细胞型n 多型细胞型1、成纤维细胞型名称： 凡在 培养中形态与成纤维细胞类似的来源 ： 由 中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态 ： 胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出 23 个长短不等 的突起，中有卵圆形核生长特点： 排列成放射状，漩涡状细胞 细胞接触易断开而 单独行动， 游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的 细胞突起成纤维细胞HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数： 4d；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类： DMEM+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。 骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数： 7天；3.放大倍数： 200倍，倒置显微镜；4.培养基种类： DF12+10 FBS；5.细胞状态与特征简述：使用 percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液 48h，这是 7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。 2、上皮型细胞名称： 仅形态上似体内，实际上不完全相同来源： 来源于外胚层 、内胚层细胞 , 如：皮肤及其衍生物 ,消化道，乳腺，肺泡 , 上皮性肿瘤形态： 类似体内的 上皮细胞扁平 ， 不规则多角形 ，中有圆形核 生长特点： 易相连 成片， 相靠 紧密相连 成薄层 铺石状生长 时呈 膜状 移动， 很少 脱离细胞群而 单个活动上皮型细胞SKOv3 （卵巢癌细胞）1.细胞种类： SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后 3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类： DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。 CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数： 1d（种在 48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类： F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长， 3 4天传代一次， Giemsa染色。3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；2.培养的天数： 3d；3.放大倍速：相差 100；4.培养基种类： PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，梭型成团生长。 4、多型细胞型n 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。SD大鼠神经元 原代1.细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数： 4-5天；3.放大倍速：电镜 20000；4.培养基种类： DMEM+10%小牛血清 +10%马 血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴突和树突。悬浮型概念： 培养时 不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源： 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点： 在 悬浮中生长良好 细胞 圆形 ，单个或小细胞团优点： 生存空间大， 提供数量大，传代方便 (不需消化 )，易于收获， 可获得稳定状态缺点： 观察不方便，很多细胞不能悬浮生长 (尤以正常细胞 )HL-60 分化细胞 Giemsa染色1. 细胞种类： HL-60； 2. 培养的天数： ATRA 1微摩尔作用 5天；3. 放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养基种类： 1640+8胎牛血清；5. 细胞状态与特征简述： 悬浮细胞 ，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或消失，胞核呈杆状或分叶状。 KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数： 5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类： RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。 HeLa细胞1.细胞种类：人 HeLa细胞传代培养；2.培养的天数： 7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类： DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。 K562细胞1.细胞种类： K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后 2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类： RPMI1640+10%胎牛血清， 4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。 每代贴壁细胞的生长过程n 游离期n 贴壁期n 潜伏期n 对数生长期n 停止期（平台期）n 游离期悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。n 吸附期贴附底物，一般 24小时内贴壁。n 潜伏期此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为 6 24小时。n 对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。n 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性根据细胞生长的恃点，传代方法有 3种：1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（ 1000转 /分 ）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2半悬浮生长细胞传代（ Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有 0.25 的胰蛋白酶液。细胞传代方法首次传代注意事项n 细胞生长密度不高时，不能急于传代 n 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 n 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 n 首次传代时细胞接种数量要多一些 n 首次传代培养的 pH应偏低些 n 小牛血清浓度可加大至 15% 20%左右 细胞计数n 计数结果以每毫升细胞数表示n 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同n 血细胞计数器：手工计数细胞n Coulter计数仪：人工计数细胞计数步骤n 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。n 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充