细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术

实 验 二细菌培养基的配制、灭菌及接种、培养技术1第一部分细菌培养基的制备、灭菌目的要求实验材料实验程序2目 的 要 求 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。3实 验 材 料 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水 等。 高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。4实 验 程 序 玻璃器皿的洗涤和包装 培养基的制备 无菌稀释水的制备 培养基和玻璃器材等的灭菌5实验程序 1 （玻璃器皿的洗涤和包装） 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。6实 验 程 序 2 （培养基的种类） 据组成成分可分为 : 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入 15 30g/L左右的琼脂。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入 3 5g/L左右的琼脂。7实 验 程 序 2 （培养基的种类）常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。8实 验 程 序 2（培养基的配制方法和步骤） 1. 取一个 300mL烧杯，装 150mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。注意： a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分b. 可加热促进各成分溶解c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。培养基配方 牛肉膏 蛋白 胨 氯 化 钠 琼 脂 蒸 馏 水 pH数量 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150mL 7.69实 验 程 序 2（培养基的配制方法和步骤） 3. 调 pH值：用 10 NaOH调 pH至 7.6，用精密 pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于 5支试管，其余全部倒入 250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。 注意不要污染棉塞和瓶口 。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在 37 下恒温培养 24h， 确定无菌生长，方可使用。10实 验 程 序 2 （培养基的分装和斜面培养基的制作）每支试管装的量为试管高度的 1/4 1/3.斜面长度为试管长度的 1/3 1/2.11实验程序 2 （培养基的配制方法和步骤）12实验程序 3 （无菌稀释水的制备） 取一个 250mL的锥形瓶装 90(或 99)mL蒸馏水，放 30颗玻璃珠 (用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒 )于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 另取 5支 18mm180mm的试管，分别装 9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。13实验程序 4 （培养基和玻璃器材等的灭菌） 加热灭菌有 干热灭菌 和 湿热灭菌 。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至 160并维持 2h；b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到 50左右，才能将物品取出。14实验程序 4 （培养基和玻璃器材等的灭菌） 湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为 100 时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。15实验程序 4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）5. 当压力达 1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为 121 )即开始灭菌 ，使其维持 15 30min。 对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ， 延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源， 待压力降至零时 ，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。7. 待培养基冷却后置于 37 恒温箱内培养 24h， 若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。1617实验程序 4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法） 间歇灭菌法： 即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。 操作方法：a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮 1次，每次在 100 煮沸 30 60min， 连续 3d重复进行。b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在 37 恒温条件下培养 24h， 这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37 恒温条件下培养 24h， 确定无菌才能使用。18实验程序 4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）过滤除菌法 ： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。19第二部分细菌纯种分离、培养和接种技术目的要求实验材料实验程序20目 的 要 求 掌握从环境中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。21实 验 材 料 无菌培养皿 (直径 90mm)10套、无菌移液管 1mL2支、 10mL1支 。 营养琼脂培养基 1瓶，活性污泥或土壤或湖水 1瓶，无菌稀释水 90mL1瓶、 9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。22实 验 程 序 细菌的纯种分离 细菌的接种方法23实验程序 1 （细菌的纯种分离）稀释平板法平板划线法24实验程序 1（细菌的纯种分离 稀释平板法）1. 取样。2. 将 1瓶 90mL和 5管 9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上 10 1、 10 2、 10 3、 10 4、 10 5、 10 6。在无菌操作条件下，用 10mL的无菌移液管吸取10mL水样 (或其它样品 )加入编号为 10 1无菌水 (内含玻璃珠 )中，将移液管吹洗三次，用手摇 10min将颗粒状样品打散。即为 10 1浓度的菌液。用 1mL无菌移液管吸取 1mL 10 1浓度的菌液于编号为 10 2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为 10 2浓度菌液。同样方法，依次稀释到 10 6 。25实验程序 1（细菌的纯种分离 稀释平板法）稀释液的制备26实验程序 1（细菌的纯种分离 稀释平板法）3. 平板的制作 取 10套无菌培养皿编号， 10 4、 10 5、 10 6各 3个，另一个为空气对照。 取 1支 1mL无菌移液管从 浓度小的菌液 开始，以 10 6、 10 5、 10 4为序分别吸取 0.5mL菌液于相应编号的培养皿内 (每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀 )。27实验程序 1（细菌的纯种分离 稀释平板法）3. 平板的制作 加热培养基，当其冷至 45左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于 30 培养 24 48h， 然后观察结果。28实验程序 1（细菌的纯种分离 稀释平板法）3. 平板的制作 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖 10min后盖上，倒置于 30 培养 24 48h， 然后观察结果。29实验程序 1（细菌的纯种分离 平板划线法） 1. 平板制作： 将融化并冷至约 50