第四章核酸电泳与检测

核酸凝胶电泳 用于分离、鉴定和纯化 DNA或 RNA片段 优点： 便于分离；便于检测；便于回收1.基本原理 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。(1)电荷效应在 pH 值为 8.0 8.3 时， DNA分子在高于其等电点的溶液中 ,核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 (2)分子筛效应在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于 分子本身的大小和构型。分子量较小的 DNA分子，比分子量较大的 DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，cccDNA IDNA ocDNA （ 3） DNA分子的大小 在凝胶中， DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数值成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 根据标准 DNA相对迁移距离推测待测定的 DNA片段的大小如何提高核酸电泳的分辨率？ （ 4）凝胶电泳的分辨力与凝胶的 类型 和 密度 相关一、凝胶类型1.琼脂糖凝胶的分辨力在 0.2 50Kb之间 ( 20kb);可区分相差 loobp的 DNA片段 ，常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离 5 500bp的片段 ;垂直装置进行电泳 效果好、分辨率极高，相差 1bp的 DNA片断就能分开，能容纳相对大量的 DNA 用于核苷酸多态性的分析不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度 （， W/ V ) DNA分子的有效分离范围（ kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2二、凝胶的密度可以通过提高琼脂糖的浓度减小凝胶孔径来提高电泳分辨率。或者改用聚丙烯酰胺凝胶。还可以降低跑电泳的电压，增大跑电泳的时间等。 如何提高核酸电泳的分辨率？ 2.影响 DNA在凝胶中迁移 速率 的因素： （ 1） DNA分子的大小：双链线状 DNA分子迁移的速率与其碱基对数值近似成反比。样品分子越大，在通过胶孔时的摩擦阻滞力越大，泳动速度越慢。（ 2）构象：超螺旋环状线状切口环状（ 3） 凝胶浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快。 凝胶浓度愈低 ,则凝胶孔径愈大 (但凝胶的强度也愈低 )。一般地分子量越大 ,选用的凝胶浓度应越小。 （ 4）电压 :低电压时 DNA片段迁移率与所用电压成正比。但随着电压上升 ,不同长度 DNA泳动的增加程度不同 ，分辨率会降低（ 5）离子强度 缓冲液中无离子时 , DNA几乎不移动 。而在高离子强度下，导电性极高 ,带电颗粒泳动很快 ,并产生大量的热 ,有时甚至熔化凝胶或使 DNA变性。 电泳缓冲液 TAE TBE TPE三者区别（ 1）缓冲容量： TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化。TBE和 TPE比 TAE花费贵，但有高得多的缓冲容量。（ 2）迁移速度：双链线状 DNA片段中 TAE中比在 TBE或TPE中迁移快 10%，（ 3）分辨率：对于高分子质量的 DNA， TAE的分辨率略高于 TBE或 TPE，对于低分子质量的 DNA， TAE要差些。超螺旋 DNA在 TAE中的电泳分辨率要好于 TBE。 TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存 5溶液 （ 5）溴化乙锭 在 DNA电泳中 ,溴化乙锭染料可插入到碱基对中 ,从而增加线性及开环 DNA的长度。加溴化乙锭后进行电泳 ,可使 DNA的泳动速度降低达 15%。3.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 当琼脂糖加热至 90 左右 ,即可熔化形成清亮、透明的液体 ,待冷至 40-45 时则可 固化形成凝胶 。基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶 成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套（ 1）琼脂糖凝胶电泳的基本过程 上样缓冲液的三个作用（ 1）增加样品密度保证 DNA沉入加样孔内（ 2）使样品带有颜色便于简化上样过程（ 3）其中的染料在电场中可以预测泳动速率向阳极迁移。 6*上样缓冲液成分：（ 2）琼脂糖凝胶中 DNA的检测通过染色 , 紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ ethidium bromide, EB）染色法和 SYBR Gold染色法。凝胶的 EB染色（ 1） EB被认为是一种 强致癌物质 ,见光分解。（ 2） EB可用来检测单链或双链核酸（ 3） EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成 10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶 或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为 0.5 g /ml 。（ 4）当要知道 DNA片段准确大小时，凝胶应在无 EB情况下电泳，电泳结束后再用 EB染色。EB替代品SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与 DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 sybr-green、 sybrgold - 不稳定， 毒性也很大 goldview -宣称无