蛋白质与dna的相互作用

蛋白质与 DNA的相互作用刘兴汉哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 分类：与单链 RNA结合与茎环结构结合与双链 DNA结合：普遍性结合特异性结合 蛋白质与 DNA结合的特性：1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和 DNA的接触区只在 DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和 DNA都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与 DNA特定硷基接触。 蛋白质与 DNA的普遍性结合中 DNA特点：蛋白质与 DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。与 DNA硷基序列特异性无关结构的匹配性：旋转对称性特定距离的相反电荷形成氢键基团排布上的匹配形成足够大的范德华力1.蛋白质和 DNA都存在 0.7nm 的重复距离DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是 0.7nm。 折叠， N原子间距离是 0.7nm伸展 折叠 C 间距离是 0.7nm 螺旋， Arg和 Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是 0.7nm.2.DNA对称性平移对称：GCATCT GCATCTCGTAGA CGTAGA二重轴对称 GCATCT TCTACGCGTAGA AGATGC 二重旋转对称GCATCT AGATGCCGTAGA TCTACG旋转对称GCATCT CGTACACGTAGA GCATGT 蛋白质与 DNA特异性结合中 DNA特点：大沟内存在特异性识别信息氨基酸与碱基对共平面氨基酸和碱基对之间形成氢键 NNOHNNN HNNONHCOOCC NHHNHHHGluAgrH 蛋白质与 DNA普遍结合中蛋白质特点： -折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合可能是通过识别小沟结构实现1.富含脯氨酸和碱性氨基酸组蛋白有重复的 SPKKSer/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与 A-T碱基对结合KPRGRPK序列也能与小沟 A-T结合2.碱性螺旋组蛋白 H1C端 57个氨基酸Lys和 Gly,Lys在螺旋两侧， Gly夹在中间3.蛋白磷酸化作用SP X X： Ser磷酸化TPKK： Tyr磷酸化磷酸化后和 DNA结合能力下降磷酸化失去氢键 蛋白质与 DNA特异性结合中蛋白质特点：1.蛋白质多形成二聚体 HTH复合物 同源盒结构 亮氨酸拉链结构NH2COOH碱性氨基酸 Agr和 Lys锌指结构 Agr和 G形成氢键 细胞核蛋白质的提取收集细胞，洗去血清和培养基裂解细胞： Triton X-100NP-40去胞浆成分裂解细胞核：高浓度 KCl :600mM变更缓冲液浓度 快速抽提裂解液： 提取液：10mM HRPES 250mM Tris1mM EDTA 60mM KCl60mM KCl 1mM DTT1mM DTT 1mM PMSF1mM PMSF pH 7.90.5% NP-40pH 7.91X107细胞100ul裂解液、冰浴 5分钟、离心沉淀用不含 NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻，反复冻融 3次离心沉淀 80 0C保存凝胶滞后试验1.蛋白质和 DNA结合复合物半衰期短电泳缓冲液低离子强度凝胶的笼效应2.探针以 20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。3.用竞争性抑制检测 DNA与蛋白质结合的特异性4.加 3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用6.只能确定结合，无法确定序列DNA足迹分析DNA足迹分析1.DNAase 随机水解核苷酸磷酸二酯键每一个 DNA分子最好只切一次2.蛋白质与 DNA结合保护 DNA不被切割3.电泳用的是变性凝胶：相差一个核苷酸 DNA彼此分开蛋白质从 DNA分子上脱落4.可确定与蛋白质结合的 DNA序列5.DNA序列是固定的随机 PCR 凝胶阻滞试验：蛋白质和 DNA结不结合，不能确定结合的序列 DNA足迹分析：蛋白质结合 DNA的序列不能确定序列硷基变化对结合的