资料二：分子生物学工具酶

分子生物学工具酶中晶生物工具酶是一类用于 DNA重组过程中不同 DNA分子的制备、切割、修饰、扩增 , 核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。概 述分类：u 限制性内切酶u 连接酶u 逆转录酶u DNA、 RNA聚合酶u 其它酶类 大多数来自不同的微生物和噬菌体 少数酶来自动物和动物病毒 另一些工具酶编码的基因也被克隆出来 , 并用大肠杆菌细胞来生产这些工具酶。一、限制性内切酶5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5EcoRI#ER0271 5000u#ER0272 5x5000u#ER0273 H,25000u市场容量： 1.5亿美金其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。 第一个大写字母：取自于属名的第一个字母 第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母 字母后面罗马字：该种生物中不同限制酶分离先后顺序限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示限制酶的命名 分离纯化：几 千种限制性内切酶 商品化： 200多种限制性内切酶限制酶的种类限制性内切酶兰白 反应推荐缓冲液作用最适温度作用产物连接效率星号活性GC甲基化末端失活高浓度Genome Qualified限制性内切酶说明书Fermentas公司30多年研发生产历史，提供 200多种高质量的工具酶 通过 ISO9002国际 质量体系认证 精湛 的实验室研发技术和实力具有全球第二大的产限制酶的菌株 (2500株 )库REBASE 中 30% 限制酶经过 Fermentas的鉴定30%II型限制修饰相关基因在 Fermentas得到克隆全球率先合成了 “人造 ”酶 (Eco57MI, N.Bpu10I) 生产 中执行最高级别的生产标准（ LO Test） 致力于 通过提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力 全球 限制性内切酶 (REs)生产的领先企业 市场份额： 20左右，个别国家超过 30的市场占有率执行最严格生产标准 PureExtreme 自 1996 年以来，只有 Fermentas始终执行分子生物学产品生产中最严格的纯度标准 “ 标记 寡核苷酸测试 ”（ the Labeled Oligonucleotide test， ”LO” test） 独 有的 “标记 寡核苷酸测试 ” 确保 Fermentas 产品 达到 PureExtreme 级别 在限制酶、 dNTPs、 DNA/RNA 修饰 酶等的生产中都进行了 “标记寡核苷酸测试 ”传统分析方法包括：非特异性核酸酶内切分析、核酸外切酶分析、连接重切分析、蓝白斑筛选分析等。但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需选择更高灵敏度的检测方法： LO TestLabeled Oligonucleotide (LO) testA Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas 不同供应商 RE LO检测分析- pure contaminated minor contaminationX *19962001通过 LO检测的 REs(%)RocheInvitrogen NEB Stratagene Promega FermentasPureExtreme 限制性内切酶 优势 所有 Fermentas内切酶都达到 PureExtreme （ 致纯） 最高品质保证 产品投诉少 严格的批间一致性 保证产品质量稳定性 几乎所以的酶都采用标准浓度 10 units/l 实时质量监督所有 Fermentas RE在 优化 Buffer中有 100%活性Easy-to-use Five Buffer Plus System每个 Fermentas RE含 两种 buffer：- 颜色 区分，优化 buffer：blue (B+)green (G+)orange (O+)red (R+)yellow (Y+/Tango)和- Universal Y+/Tango Double Digest buffer浓度优化的 BSA预先 加入所有 RE缓冲液 中改进的 REsearch /research/appDoubleDigestion，双酶切/doubledigest/index.htmlDoubleDigest 提供 DD最佳反应条件/doubledigest/double.phpFermentas RE畅销排行榜（ Top 20） BamHI BcuI (SpeI) BglII EcoRI Eco47III Eco57I HindIII MboI MnlI NotI NcoI NdeI NheI PaeI (SphI) SacI SalI TaiI (MaeII) Tru1I (MseI) XbaI XhoI 补充： PstI与 竞争对手的比较 LO 测试 达到 PureExtreme: 无其它活性的污染 种类 第二多 ISO9002 认证 和 质量 控制 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango ，通用 双酶切 buffer 列出有效期 , 通过实时监控保证 100活性 价格优势 未经 LO测试 , 但有很多重组内切酶 种类第一多 无认证，质量 控制未核实 单独提供 BSA 无双酶切 用 buffer 仅有出厂化验日期 , 距客户购买日期可能会有一年之久 价格相当Fermentas vs NEB与 竞争对手的比较 LO 测试 达到 PureExtreme: 无其它活性的污染 种类 第二多 ISO9002 认证 和 质量 控制 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango ，通用 双酶切 buffer 列出有效期 , 实时监控保证 100活性 价格优势 未经 LO测试 , 种类较少，约 100种 有认证，质量控制不严 Buffer中加有 BSA 无双酶切 用 buffer 列出有效期 价格相当Fermentas vs Takara与 竞争对手的比较 LO 测试 达到 PureExtreme: 无其它 活性的污染 内切酶种类第二多 ISO9002 认证 和 质量 控制 列出 有效期 , 通过 实时监控保证 100活性 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango ，通用 双酶切 buffer 专注于内切酶方面 价格优势 未经 LO测试 内切酶 种类少 有 认证 11种 buffers及 Multi-Core 4, 不提供 BSA 未提供双酶切的详细信息 非主要 产品线 大幅度 折扣Fermentas vs Promega与竞争对手的比较 LO 测试 达到 PureExtreme: 无其它活性的污染 内切酶种类第二多 ISO9002 认证和质量控制 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango ，通用双酶切 buffer 价格优势 未经 LO测试 有认证 非主要产品线 9种 buffers, 不提供BSA 未提供双酶切的详细信息 大幅度折扣Fermentas vs InvitrogenFastDigest Restriction EnzymesFastDigest 限制性内切酶 FastDigest 5min digestion1l of enzyme37oC temperatureONE bufferFor ALL FastDigest enzymes超过 70多种 FastDigest酶数量快速增长产品特点 独特的产品线 酶切质粒 DNA只需 5 min at 37C 特殊的形式： 1l enzyme 无需换算酶切单位 通用 Buffer，针对所有的酶切实验 一种温度： 37C反应 200ng 纯化的质粒 DNA (5 min酶切 ) 适合单酶切、双酶切和三酶切反应 操作简单：无需考虑酶量、 Buffer、温度和星活性客户定位基因的体外突变等诸方面限制性内切酶的应用各种 DNA分子的体外重组限制酶谱的绘制基因的亚克隆分析基因和染色体结构的分析限制性内切酶使用常见问题分析（一）Q1、 DNA完全没有被内切酶切割1) 内切酶失活：标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有 SDS，酚， EDTA等内切酶抑制因子：将 DNA过柱纯化，乙醇沉淀 DNA3) 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对 DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒 DNA转化至 dcm-， dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如 Dpn I）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化 DNA（如 San3A I代替 Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增6) DNA位点上存在其它修饰：将 DNA底物与 DAN混匀进行切割验证7) DNA不存在该酶识别顺序 ：换用其它的酶切割 DNA或过量酶消化进行验证限制性内切酶使用常见问题分析（二）Q2、 DNA切割不完全1) 内切酶活性下降：用 5-10倍量过量消化2) 内切酶稀释不正确 ：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3) DNA不纯，反应条件不佳 ：同上4) 内切酶识别的 DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 ：同上5) 部分 DNA溶液粘在管壁上 ：反应前离心数秒6) 内切酶溶液粘度大，取样不准 ：将内切酶稀释，增大取样体积7) 酶切后 DNA粘末端退火 ：电泳前将样品置 65 保温 5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 ：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9) 过度稀释使酶活性降低 ：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10) 反应条件不适 ：使用最佳反应体系11) 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 ：加大酶量 5-10倍限制性内切酶使用常见问题分析（三）Q3、内切酶保存期内快速失活1) 保存温度不当 ：贮藏在含 50%甘油的贮藏液中， -20 低温保存2) 以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3) 贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液4) 低蛋白浓度：内切酶与 500ug/ml的 BSA一起保存Q4、酶切后的 DNA片段连接效率低1) 含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2) 内切酶失活不全或含有 ATP酶：内切酶失活不全或含有 ATP酶 3) 平末端连接：加大 T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收 DNA5) 连接缓冲液不合适 ：重新配制连接缓冲液限制性内切酶使用常见问题分析（四）Q6、电泳后 DNA片段的带型弥散，不均一1) DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液 65 加热 5min，并加入 0.1%的 SDS，酚 /氯仿抽提纯化2) 内切酶中含有 DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶Q5、 DNA片段数目多于理伦值1) 内切酶星状活性：检查反应条件：甘油