【毕业学位论文】（Word原稿）生防菌JK-2粗毒素活性物质分析及对香蕉枯萎病诱导抗性的研究

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： (S/B) 福建农林大学硕士学位论文 生防菌 毒素活性物质分析 及对香蕉枯萎病诱导抗性的研究 学 科 门 类：农学 一级学科名称：植物保护 二级学科名称：农药学 研 究 方 向：生物农药 研 究 生：杨述省 指 导 教 师：林乃铨教授 刘 波研究员 完 成 时 间：二 00 九年四月 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学 有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 2006 级福建农林大学硕士学位论文 录 中文摘要 . V 英文摘要 . 言 . 1 1 生防细菌种类及其在病害防治中的应用概况 . 1 2. 生防细菌抗菌机制 . 2 争和定殖作用 . 2 寄生作用 . 2 进植物生长 . 2 抗作用 . 2 导植物抗病性 . 3 3 微生物源抗真菌物质的研究进展 . 3 制细胞膜合成 . 3 制细胞壁合成 . 3 制蛋白质合成 . 4 制电子传递，影响能量系统 . 4 制核酸合成 . 4 . 5 学物质对植物抗病性诱导的研究 . 5 物因子对植物抗病性诱导的研究 . 6 5 本研究的意义 . 7 第二章 生防菌 脂肪酸生物标记指纹图谱及粗毒素抑菌活性 的初步研究 . 8 前言 . 8 1 材料和方法 . 8 验材料 . 8 短芽孢杆菌 脂肪酸生物标记指纹图谱测定 . 8 防菌 长曲线的测定 . 9 防菌 毒素的制备及抑菌谱的测定 . 9 原菌孢子悬浮液的制备 . 9 防菌 毒素对指示菌的生物活性测定 . 9 2 结果与分析 . 10 防菌 脂肪酸生物标记指纹图谱 . 10 防菌 生长曲线与生防菌粗毒素采样时间 . 10 2006 级福建农林大学硕士学位论文 防菌 毒素拮抗病原菌的生测结果 . 11 防菌 毒素对指示菌的活性测定 . 11 3 讨论 . 15 第三章 生防菌 菌活性物质的研究 . 16 前言 . 16 1 材料与方法 . 16 验材料 . 16 外蛋白的分析 . 16 外多糖的分析 . 17 2 结果分析 . 18 外蛋白的分析结果 . 18 外多糖的分析结果 . 20 3 讨论 . 22 第四章 生防菌 株对香蕉组培苗相关酶活性的影响 . 23 前言 . 23 1 材料与方法 . 23 验材料 . 23 株对香蕉组培苗侵染条件的研究 . 23 液的提取及酶活测定方法 . 23 2 结果分析 . 24 防菌 株对香蕉组培苗侵染的结果 . 24 防菌 多酚氧化酶（ 性的影响 . 25 防菌 过氧化物酶（ 性的影响 . 26 防菌 超氧化物歧化酶（ 性的影响 . 27 防菌 丙二醛（ 性的影响 . 28 3 讨论 . 29 第五章 生防菌 株对香蕉枯萎病诱导抗性的研究 . 31 前言 . 31 1 材料与方法 . 31 验材料 . 31 液提取和酶活测定方法 . 31 . 31 香蕉枯萎病菌对香蕉组培苗多酚氧化酶（ 性的影响 . 31 香蕉枯萎病菌对香蕉组培苗过氧化物酶（ 性的影响 . 33 香蕉枯萎病菌对香蕉组培苗超氧化物歧化酶（ 性的影响 . 34 2006 级福建农林大学硕士学位论文 香蕉枯萎病菌对香蕉组培苗丙二醛（ 量的影响 . 35 . 36 参考文献 . 38 附录一 . 43 附录二 . 44 附录三 . 45 个人简 历 . 46 参与课题 . 46 致 谢 . 47 2006 级福建农林大学硕士学位论文 V 中文摘要 (1) 生防菌短短芽孢杆菌 (本实验室从土壤中分离得到一株芽孢杆菌菌株，经中科院及实验室的脂肪酸鉴定仪鉴定其为短短芽孢杆菌，研究发现其对枯萎病原菌，青枯菌均具有一定的拮杭作用，而且能够分泌抗菌物质到发酵液中。测定了短短芽孢杆菌 (生长曲线；对其粗毒素性质进行考察，结果表明：在 30 ， 170 r/条件下，恒温振荡培养 48 h，在以香蕉枯萎病菌病原菌作为指示菌的条件下，该菌株粗毒素具有一定的热稳定性；其粗毒素抑菌作用的最适 为 和 ，仍能维持较高的抑菌活性；此粗毒素对光照、蛋白酶 K、紫外照射均不敏感。 (2) 经硫酸铵沉淀后粗毒素基本失去活性。采用 80%的无水乙醇对粗毒素进行处理，实验结果表明：上清和沉淀溶解液均对香蕉枯萎病菌具有抑菌活性，但是在 100 水浴 ， 沉淀失去活性。而上清的活性基本没有变。这说明粗毒素中至少存在两种活性物质。采用光谱扫描、 手段对处理液进行了研究。对 外多糖采用柱层析、薄层层析及红外光谱等方法，确定其组成分。 用 进行分离，皆出现明显单峰；分子量为 04含有羧酸、吡喃单体，但无乙酰酯 。 (3)研究了 果表明：在30 ， 12 2 且延迟了 部 部和叶片 且 片根部茎部。 (4) 设置了不同处理对其诱导抗性进行了研究。在香蕉组培苗上接种香蕉枯萎病病菌和 定 活性及 量变化。结果表明：接种 株发酵液处理的性明显高于其他处理，对其活性诱导分别在 6d、 4d 以 后但是病原菌首先对 生影响，所有处理对植株根茎的 性与对照相比无明显变化，但是单独接种香蕉枯萎病菌的处理使叶片的性明显提高；接种病原菌和生防菌均使植株 量有不同程度的升高，但是同时接种两种菌的处理使植株的 变化较小。因此，经处理后对于植株的利弊有待于进一步研究。 关键词 : 短短芽孢杆菌；抗菌物质；诱导抗性 2006 级福建农林大学硕士学位论文 he of of to 文摘要 (1) by by of it . f. to 6 h 0 , 170 r/to a of h at It 0 . pH of At .0 It a to , (2) of by 0% f. 00 .5 h in a of at of of to of it is 04 Da - (3) of s In 0 , 12 h 2 h be PO OD K, POs s in ODs of K. K, DA in of (4) We up in to s, s PO,s DA d, 4d OD of of K no OD of f. DA in at of to be 006 级福建农林大学硕士学位论文 1 第一章 文献综述 前言 生物防治是利用有益微生物杀灭或降低病原生物的数量以控制植物病害发生、发展的一类措施 1。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群密度，即生物群防治生物群。生物防治包含 3 个方面的策略或方法： 1)调节病原物种群，用生物控制因子将病原物种群数量控制在一个允许的阈值水平以下； 2)保护性排除方法，以有益微生物通过位点营养竞争作障碍，排除病原物侵染 ； 3)自身防御，以寄主植物抗性预防或抑制病害发生，如诱导抗性 2。 近几十年来，植物病虫害生物防治研究发展迅速，它的应用日益受到农业和环保的重视。而植物病虫害的微生物防治是植物病虫害生物防治的一条重要途径，微生物农药的研制、开发与商品化正在迅速发展。而生防菌在生产实践的应用受到生防菌自身的特点，接种方式，环境条件等诸多因素的影响。生防菌抑病机理研究以及生防菌代谢物活性物质的分析是实际应用研究的基础。 1 生防细菌种类及其在病害防治中的应用概况 生物防治技术在我国有着悠久的历史，诗经中 螟蛉有子，蜾嬴负之 的诗句，表明两千多年前古代人对生物互相制约现象的认识。但把生物防治作为近代科学研究是从 20 世纪 30 年代开始的。微生物农药的研制和商品化生产以苏云金杆菌最为突出， 剂是生物农药研究领域中实现大规模生产化的一个主导产品。生防菌的种类繁多，生产上广泛应用 的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。 细菌因其庞大的种类和数量、高速的繁殖力、复杂的代谢活动、对病原物的作用方式多样、又易于人工培养等特点，在自然发生的生物防治和人类应用生物防治的活动中，拮抗细菌及其代谢产物都起到了重要的作用 3。目前应用较多的生防细菌主要 有芽孢杆菌 (、假单胞杆菌 ()、土壤放射杆菌 ( 4。 芽孢杆菌是目前生防细菌中研究较多的一类 5，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受各国研究工作者的青睐，是筛选生防菌很好的对象 6。用于生防芽孢杆菌的种类有枯草芽孢杆菌 (B 多粘芽孢杆菌 (B 蜡状芽孢杆菌 (B 地衣芽孢杆菌 (B. 巨大芽孢杆菌 (B. 短小芽孢杆菌 (B 7。应用芽孢杆菌可防治的植物病害有马铃薯疮痂病、番茄青枯病、苹果红腐病、小麦赤霉病以及其他一些土传和地上病害 4。国外利用枯草芽孢杆菌 (B 治由水稻纹枯病菌 (腐霉菌 (、镰刀菌 (引起的病害，取得较好的效果 8；澳大利亚开发 的枯草芽孢杆菌 麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传性病害具有很好的防治和增产作用 9。国内利用枯草芽孢杆菌防治苹果轮纹病，取得了较好的效果 10；对桃和油桃褐腐病的抑制效果显著 11；对西瓜枯萎病菌大、小分生孢子的萌发及芽管的生长均有明显的抑制作用 12。此外，多粘类芽孢杆菌对灰霉病菌有较强的拮抗活性和定殖能力，并诱导番茄植株对灰霉病产生系统抗性 13。短芽孢杆菌对苹果斑点落叶病有较好的防效 14，能抑制草莓灰霉病菌的生长以及对小麦根腐病有强抗生作用 15。 假单胞杆菌 (大量存在于植物的根围和叶围，土壤中是以不同生物型的荧光假单胞杆菌 (P. 主，目前应用的主要种类有荧光假单胞杆菌 (P. 洋葱假单胞杆菌 (P. 恶臭假单胞菌 ( P. 4。其中荧光假单孢杆菌 (是报道最多、在2006 级福建农林大学硕士学位论文 2 防治土传病害方面应用效果较好的一类生防菌，对马铃薯、黄瓜、甜菜、豌豆、胡萝卜、小麦等常见土传病害如猝倒病、枯萎病、软腐病、小麦全蚀病等皆有不同程度的防治 效果，且该菌附着在植物根际兼有对病原菌的拮抗作用和对其根际主要微生物直接或间接作用的综合效果 16。何礼远等人用荧光假单胞菌 株对花生种子浸泡接种，菌液对土壤中青枯菌的侵染具有明显保护能力。楼兵干等发现铜绿假单胞菌 (理种子时，能有效防治由腐霉 (和茄丝核菌(起的黄瓜和番茄的苗期猝倒病 17。 放射性土壤农杆菌 (作为生防因子成 功应用的首例是 在澳大利亚使用放射性土壤农杆菌 株防治由根癌土壤杆菌 (A. 起的果树冠瘿病和预防根癌肿病18。近年来，我国分离出对葡萄根癌病有显著防效的土壤放射杆菌 大田试验具有一定的防效 19。此外，曾有报道具有分泌几丁质能力的节杆菌 ()可用来防治由石竹尖镰孢 (f. 起的香石萎蔫病和由小麦全蚀病菌 (致的小麦全蚀病 4。 用在植物病害生物防治中的放线菌主要是链霉菌属 (及小单孢菌属 (20主要防治一些常见的土传病害病原菌，如腐霉菌 (、镰刀菌 (、疫霉菌 (和丝核菌等 21。 在生防真菌开发应用方面，迄今研究应用较多的是木霉属各种 ( 22。据不完全统计，木霉菌至少对 18 属 29 种病原真菌表现拮抗 活性 23。拮抗木霉主要有哈茨木霉 (绿色木霉(钩状木霉 (T 长枝木霉 (康氏木霉 (以及新近归为粘帚霉属的绿粘帚霉 (目前已商业化的产品主要是哈茨木霉菌株及少量的绿色木霉菌株 24多数用于核盘菌属 (疫霉属、丝核菌、腐霉属、镰孢属轮枝孢属(所致土传病害的 防治 25。 2. 生防细菌抗菌机制 争和定殖作用 竞争作用即生防微生物通过对营养物质的争夺、物理和生物学位点的抢夺等方式控制植物病原微生物的发展。在作物根表存在着一些适合细菌生长和繁殖的有利位点，有益微生物抢先占领这些位点，有效地利用根围营养和分泌物，减少病原菌所需的营养物质 ;或者占据了生态位点，阻止和降低了有害菌在这些位点的建立。竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一，涉及生防微生物在植物根际或体表或体内的定殖、繁殖与种群的建立及与病原微生物的相互作用。竞争方式有空间竞争、营养竞争 26。 关于定殖的定义国内外不同研究者具有不同的概念，但是定殖都应包括以下几个方面：一是能够在植物根际生存下来，二是能以植物根际作为生防菌本身适合的环境而繁殖，随着植物根系的发达而庞大，通过与其它生物竞争而形成一个较大的群体 27。 寄生作用 由水解酶介导的重寄生是生防菌的作用机制之一 28。植物病原高等真菌的细胞壁是以几丁质为骨架，以 于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状态。易被水解酶所攻击而导致 细胞破裂，生长受阻或者细胞死亡，阻止病害的发生发展 26。 进植物生长 1993 年报道植物根际的链霉菌具有固氮作用，可与植物形成共生关系，促进植物的生长。弗兰克氏菌共生固氮放线菌能够诱导大范围的放线菌根瘤植物产生根瘤，并促进植物对 元素的吸收。从而也增强了植物对环境胁迫的抗性 26。 抗作用 拮抗作用是生防微生物防治植物病害的一个重要机制。拮抗微生物的抗生作用指拮抗微生物通过分2006 级福建农林大学硕士学位论文 3 泌一种或多种拮抗物