生化仪器中的空白定标和质控

生化中的定标和空白 n 定标的意义： 定标就是要找出一个参考点，就是一个 K值 （或 F值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们 测定一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分 析仪，测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没 有什么意义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶 的活性。那就要乘上一个 K值，计算并打印出来的结果对 我们就有意义了。 K值就是我们通过定标找出来的。一般 上最低要求是由试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个 吸光度。 K=标准浓度 /(A标准 A试剂空白 ) 标准液的浓 度我们是知道的，这两个吸光度可以由仪器测出，这样就 得出一个 K值。无论什么样的标本，用其吸光度乘以 K值 我们就得到了答案。因此， K值具有非常决定性的意义， 可以决定标本的准确性。 K值的决定因素： 我们看看 K值 会受到什么影响呢？ 第一，标准液的浓度一定要准确（ 标准液最好与标本一样是以血清为基质的）。 第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要 准确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂是影响 K值的一个主要 因素。 如何确定 K值是正确的？ 一般我们用质控 血清来检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果很好，可以说 K值是准确的，用这个 K 值计算出来病人的结果也是准确的，所以 K值非常 关键。 K值的真面目： K值实际上代表了斜率， 截距代表试剂空白，试剂空白每天都在变化，所以 K值的稳定性决定您的仪器与试剂，如果仪器与 试剂都十分稳定，那 K值也很稳定。 多长时间定 一次标合适？ 这要看您试剂的稳定性，质控结果 不好，有些项目做试剂空白可以解决，有些项目要做两点定标。 酶的项目如何确定 K值： 一是计 算出来的理论 K值； K = (TV 1000)/(SV L ) 二是用有酶项目的定标液得出 K值：目前各公司可 以提供多项目的定标液，不仅有底物类的项目， 也有酶类的项目。 生化检验中的各种空白概念 n 1、试剂空白： 由于生化测试测量的吸 光度为相对吸光度，所以从理论上说，所 有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光 度扣除。试剂本身的吸光度就是 试剂空白 。测量方法是按照正常测试的试剂和样本 量 n 把样本换成蒸馏水来测量。 在传统手工方法 中 ,每次测定都要做至少三个管 :测定管、标准管 、空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出 来也就是试剂空白。因为 操作环境、仪器状态 、试剂稳定性等变异，所以要求每次都要测定 试剂空白，称为实时试剂空白。 在全自动分 析仪上，大体上是模拟手工操作。但许多全自 动分析仪为追求速度，在设计上采用一些折中 方法来测定试剂空白。以日立全系 列生化仪为 例。该系列分析仪是做不了实时试剂空白，因 为它们全是先加入样本后加试剂，为了折中， 只好在定标时做一个试剂空白，保 存起来，需 要扣除试剂空白时再减这个预先保存的值。这 种做法，对于比较稳定的试剂来讲，对结 n 果影响不大。 通俗的讲，日立的仪器工作 流程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加入 R1试剂、 R2试剂，所以试剂空白在每个 测定项目曲线 中是无法看到的。但是 7600从 CALIBRATION中是可以看到的， S1ABS就是代 表试剂空白吸光度，在 CALIBRAT ION画面里 的下方找到 Reaction Monitor（反应监察），其中 STD(1)就是代表试剂空白反应曲线 .为了减小误 差，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到 FIRST和 SECOND两条，计算时是取他们的平均 值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳 定，积极采取措施纠正。对于日立 的这种试剂 空白测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试 剂空白校准。 总的说来，自动生化仪上的试 剂空白一般表现为零点吸光度，该吸光度是通 过校准确立的。 n 2、样本空白： 由于溶血、脂血、黄疸等情 况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成 影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本 空白，可以去除这 方面的影响。测量方法是按 照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏 水或生理盐水来进行测量。自动生化仪上，很 难界定样本空白。 与消除样本空白有关的大约 有如下几点 : a).在双试剂测定时，加入试剂 1 和样品后的吸光度可一定程度上扣除样本空白 ，所以有单 试剂不能扣除样本空白的说法。 b).现在优质的试剂的抗干扰能力都比较强，比 如有些双试剂， R1加入后先和样本孵育一段时 间，将血红蛋白、脂肪 n 胆红素等反应 掉，再加入 R2开始测定反应。在 一定范围内都可以消除样本空白。 c).现代全 自动生化仪大多采用双波长测定 .双波长测定的 原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰 形特征，选择两个波长和 ，使干扰组分在这两 个波长处的吸光系数相等，而使待测物质在两 波长处的吸光系数有显著差别。以两波长分别 测定分析溶液的吸光度， 以两个吸光度值之差( A)计算。这也可以扣除一部分样本空白 . d).有些仪器 ,例如日立系列 ,有专门的 “血清信息 ” 功能的设置。做法都是单 独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空白校准。 3、水空白： 比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意义 主要是对光路系统进行检查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算中起到消除 “杯差 ”的 作 用。日立 7060中的 Cell Blank（杯空白）测定的就 是水空白。 全面质量控制的内容 n 全面质量控制的内容主要包括分析前、分 析中、分析后这三个主要过程的质控。 n 只有认真的检测和控制这三个过程中各个 环节可能出现的误差，才能保证最后检测 结果的准确性，才能达到我们的质量要求 。 （一）分析前质控 n 人员培训 n 实验室的设置 （水、电、相关设备、用具等） n 实验仪器的质量保证 (仪器的精度、波长的准确度 ) n 检测方法的选择和评价 （重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验） n 试剂和标准品的选择和评价 （线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验） n 标本准备 （血清、血浆、胸腹水等 ) （二）分析中质控 n 建立项目操作程序 标准化的操作规程（ SOP文件）。 n 室内质控和结果分析 对各个项目进行室内质量控制，并对质控 结果进行分析与处理。 （三）分析后质控 n 审核实验结果 n 室内质控的数据管理 n 参加室间质量评价 n 建立投诉调查与反馈机制 二、临床生化检验室内质量控制 n （一）、概念与意义 n 室内质量控制： 指各实验室为了监测和评 价本实验室工作质量，以决定常规检验报 告能否发出，而采取的一系列检查，控制 手段，包括实验室工作的全过程。 n 意义： 是检测常规工作中的精密度，并观 察准确度的改变，提高本实验室常规工作 中天内与天间标本检测的 一致性 。 n 要进行室内质量控制就必须要有 指示物 对 各项目的质量进行指示和判断，来说明质 量好坏的情况， 指示物 就是我们需要的 控 制物（也称质控物） 。 n 控制物定义（也称质控物）： 含有被检测 的化学成份，用于监测实验室的 精密度和 准确度 的一种指示血清（溶液）称之为控 制物。 n 标准品定义（参考物）： 是指它的一种或 几种物理或化学性质已经充分被确定，被 用于 校准仪器或证实一种测定方法 的物质 。 2 质控品应具备的特性 n 人血清基质，因它的基质效应小 . n 无传染性 . n 添加剂和调制物的数量尽可能少 . n 瓶间变异小， （ 1） 酶类项目瓶 CV应小于 2， 其它分析物 CV应小于 l （ 2） 某些不稳定成分 (如胆红素、 ALP等 )在复溶后前 4小时 的变异应小于 2 . （ 3） 冻干品其复溶后， 2 8 环境中 稳定不少于 24h， 20 环境中 稳定不少于 20天， n 到实验室后的有效期应在 1年以上 . 室内质控血清浓度水平要求 n 、三级以上医院的临床实验室，定量测 定每批 (不超过 24小时 )至少使用两个浓度 水平的质控血清。 n 、二级、一级医院临床实验室，至少使 用一个浓度水平 (医学决定水平 )的质控血 清。 n 、 医学决定水平： 是指某项待测物的含 量，围绕该浓度的升高或降低，对确定疾 病的诊断或治疗起帮助甚至关键的作用。 统计学的基本概念 、精密度： 测定值与均值之间的差值情况 称为精密度，差值越大精密度越差，反之 越好。 、准确度： 测定值与真实值之间的差值 情况称为准确度，越接近真值准确度也好 ，反之就越差。 室内质量控制的主要方法 常规质控图（ S）法 Westgard多规测质控法 6西格玛 质控图法 4.日常标本测定结果均值图法 常规质控图（ S ）法 n 这种方法操作简单，直观，易懂，它具有 成熟的理论和实际经验，它只需要单一浓 度的质控血清就可实现对临床进行室内质 量控制，是目前国内外采用最广泛的一种 常规室内质量控制的方法。 n 也称为均值 -标准差质控图法，也称 levey- Jenning质控图法。 在纵坐标上标出 X、 X2SD、 X3SD的标 志，横纵标上标出日期或次数。 用红笔划出 X2SD作 为警告线； 用蓝笔划出 X3SD作为出控线。 这样称为一张空 OCV或 RCV图。 质控图上所包括的内容 常规靶值 、 控制限 的确定： n 一个月结束后 ,将该月的 在控结果 与前 20 个质控测定结果汇集在一起，计算累积 X 、 S、 CV,再作为第二个月的 IQC的暂定 靶 值 和 控制限 ，观测第二个月的 IQC。 n 以此重复个月建立常规的 靶值 、 控 制限 。 n 在计算累积值的时候需去掉超过 3SD 的 数据 n 室内质控的结果分析 n （ 1）测定值的分布规律 n 95%的测定结果应落在 X2SD范围内。 n 不能有连续 5次结果逐渐上升或下降。 n 不能有连续 5次结果在均值的同一侧。 n 不能有连续 2次结果在 X2SD 以外。 n 不能有数据落在 X3SD 外。 如违反上述规律时，称为失控。 n （）质控图的几种 失控表现 曲线漂移： 是由于 系统误差造成，准确 度发生了一次性的向 上或向下的改变，这 种往往是由于一个突 然出现的新的情况引 起。如更换质控血清 、试剂及操作人员。 n 趋势性变化 ：质控 图趋势性向下或向上 变化。表明检测的准 确度发生逐渐的变化 ，这种变化多发生是 由于一个逐渐改变的 因素造成的。如试剂 的挥发、吸水、沉淀 等。 n 精密度变化 ： 仪器、试剂或方法学不稳 定 n 8、 失控后处理 n 迅速回顾，检查整个操作过程。是否有发生 错误的 环节 ，包括 试剂、方法、波长 ， 以及程 序等出现差错。 n 如操作步骤均无问题，可重复试验一次，如 有改进， 说明误差很可能操作错误所致 ，标本 量，试剂量的错误，或波长选择错误所致。 n 如仍不能更正，可取一份 新鲜 的控制血清重 作。 n 仍不能解决问题，取一份 定值血清重做 。 n 仍不能解决，应 仔细检测仪器 。 n 仍未得到纠正， 试剂、质控血清重新配制和 溶解 ， 仪器保养检修，全部重新查找原因直到 问题解决 。 n 1、方法： n 要求在常规条件，同时测定 2份不同浓度 的定值质控血清，所含测定物浓度最好分 别为医学决定水平的上限或下限。 Westgard多规则法 2 常用的质控规则 n 质控规则以符号 AL表示： (1)A是指超过质控限 (L)的质控测定值的个 数 (2)L是质控界限。 (3) 1 2s质控规则 ,A=1,L=2s n 当质控测定值超过了规定某规则要求时， 应判该批分析违背此规则。 n 1 2s：有 1个质控测定值超过 X 2s，该规则 称为 “警告规则 ”。 n 13s规则： 1个质控测定值超过 X 3s质控限 。此规则多由随机误差造成 n 22s规则 :2个连续的质控测定值同时超过 X 2s或 X 2s质控限。此规则主要由系统误差 造成 n R4s规则：在同一批内进行两种不同浓度质 控品监测时 ,高浓度测定值与低浓度测定 值之间的差值超过 4s。此规则多由随机误 差造成。 n 41s规则： 4个连续的质控测定值同时超过 X 1s或 X 1s。此规则主要由系统误差造 成。 n 10x规则： 10个连续的质控测定值同时落 在均值（ X）的同一侧。此规则主要由系 统误差造成。 n Westgard多规则的主要特点是： 是在 Levey-Jennings方法基础上发展起来 的，因此 ,它很容易与常用的 Levey- Jennings质控图进行比较并涵括后者的结 果； 通过单值质控图进行简单的数据分析和 显示 具有低的假失控或假报警概率； 当失控时，能确定产生失控的分析误差 的类型，由此可帮助确定失控的原因以寻 找解决问题的办法。 n 最初的 Westgard多规则通常有六个质控规 则，即 12s、 13s、 22s、 R4s、 41s、 10x。 n 其中 12s规则是是一种警告规则也是 Westgard法的启动规则，它有助于对质控 数据的快速判断。 n 为了表达的方便，通常以 “ ” 符号将各 项质控规则联接起来，如 13s / 22s/R4s 41s 10x。 n 在实践中 13s或 R4s规则常检出随机误差， n 而 22s 、 41s 、 10x质控规则检出系统误差。 IQC中需要注意存在的问题 n 注意的问题 ： n （ 1）质控血清必须完全溶解和融化后才 能使用，同时， n （ 2）必须有准确的加样器，而且水的质 量一定要得到保证。 n （ 3）质控血清必须与常规标本同等对待 ，不得特殊处理，只有这样才能真正反映 常规工作的质量。 n （ 4）质控血清测得值应及时在质控图上 。确认没有失控后，再填发当天的检验报 告。 n （ 5） 通过质控图寻找出现误差规律。在 失控时查找原因，均需要各方面详细记录 ，才能进行正常分析， 因此必须养成良好 的实验记录习惯。 n （ 6） 单纯依靠质量控制制图监测工作质 量是不够的。特别是对于过失误差，是无 法用统计学方法去发现的。 n 存在的问题 n （）质控标本对质控过程的监控不够， 一般只在早晨调机时做一次质控标本。 n （）将质控血清反复测定多次，取其结 果均值作为当天质控血清的检测值。因在 取均值过程中抵消了大部分随机误差，使 结