(介绍)调节性t细胞研究进展

提要：调节性 T 细胞是不同于 Th1 和 Th2 的具有调节功能的 T 细胞群体，因其具有免疫 抑制作用，近来受到人们的广泛关注，本文综述调节性 T 细胞近来的研究进展。 关键词：调节性 T 细胞；细胞因子；免疫 调节性 T 细胞是不同于 Th1 和 Th2 的具有调节功能的 T 细胞群体，具有免疫抑制功能， 在多种免疫性疾病中起重要的调节作用，成为近年来免疫学领域研究的重要内容。 1 调节性 T 细胞分类 调节性 T 细胞（ Tr）在体内外具有调节功能，根据其表面标记、产生的细胞因子和作用 机制的不同，Tr 可分为 CD4+CD25+Tr 细胞、Tr1 和 Th3 等多种亚型。 1.1 CD4+CD25+Tr 目前研究得较为清楚的亚型为 CD4+CD25+Tr。研究表明，在正常 人和小鼠的外周血及脾脏组织的 CD4+T 细胞中约有 5%10% 的细胞持续表达 CD25 分子 （IL-2 受者 链），同时这一亚群是 CD45RB 分子低表达的。CD4+CD25+Tr 具有免疫无 能性和免疫抑制性两大功能特性。其免疫无能性表现在对高浓度 IL-2 的单独刺激，固相包 被或可溶性抗 CD3 单抗，以及抗 CD3 单抗、抗 CD28 单抗的联合作用呈无应答状态，也不 分泌 IL-2。当经 TCR 介导信号刺激并有高浓度外源 IL-2 存在的情况下，CD4+CD25+Tr 可 活化并增殖，但其增殖程度较 CD4+CD25-T 细胞弱很多。 CD4+CD25+Tr 的免疫抑制性表现在经 TCR 介导的信号刺激活化以后能够抑制 CD4+和 CD8+T 细胞的活化和增殖。 1.2 Tr1 Tr1 是另一类亚型的 CD4+Tr。在 IL-10 存在的情况下，可通过异源抗原活化 的人类 T 细胞经克隆产生，IFN- 可增强 IL-10 诱导产生 Tr1 的能力。另外 ，抗原与 CD2 共刺激可通过 IL-10 非依赖途径诱导产生抗原特异性 Tr，产生大量 IL-10，并具有调节功 能。最近 Kemper 等研究发现，在 IL-2 存在的情况下，人 CD4+T 细胞与 CD3 和补体调节 剂 CD46 结合诱导生成 Tr1 特异性细胞因子表型的 T 细胞。这种细胞增殖能力强，并具有 旁观者抑制效应和免疫记忆力。Tr1 与 Th1 和 Th2 之间的区别于 Tr1 可产生高水平的 IL- 10，中等量的 TGF-、IFN- 和 IL-5，少量的 IL-2，不产生 IL-4。刺激 TCR 不能使 Tr1 有 效增殖，有研究显示 IL-15 对于刺激 Tr1 在体外增殖至关重要。 Tr1 抑制免疫反应的主要 机制依赖于产生具有免疫调节功能的细胞因子如 IL-10 和 TGF-。 1.3 Th3 Th3 型 CD4+Tr 是在研究口服耐受机制的过程中发现的，Th3 主要分泌 TGF- ，对 Th1 和 Th2 都具有抑制作用。Th3 可从 IL-4 缺陷小鼠产生，显示 Th3 是与 Th2 不同 的一种独特类型。TGF-、IL-4、IL-10 可促进 TCR 转基因小鼠 Th 前体分化为 Th3。低剂 量抗原口服诱导产生 Th3，同时口服 IL-4 可促进 Th3 的产生。 由于不成熟树突状细胞（DC）在体外诱导产生的 CD4+Tr 和体内诱导产生的 CD8+Tr 与 Tr1 具有相同的特性，即都产生高水平的 IL-10，但不产生 IL-4 或 IL-2。然而，与 Trl 比较， 不成熟 DC 诱导产生的 CD4+Tr 在体外的抑制活性不依赖于 IL-10。并且，由不成熟 DC 在 体外诱导产生的 CD4+Tr 通过抗原非依赖机制直接抑制成熟 Th1 的增殖反应，该过程需要 细胞与细胞之间的接触，并可被外源性的 IL-2 所抑制。因此，从功能上讲，这些 Tr 更类 似于上述的 CD4+CD25+Tr。 目前还不清楚 CD4+CD25+Tr 与 Trl 之间的关系，有人认为它们可能是处于不同分化阶 段的同一 Tr 亚型，CD4+CD25+Tr 可能来源于胸腺部分分化的 T 细胞，并在外周遇到抗原 时最终分化为产生 IL-10 和 TGF- 的 Trl。但较多倾向认为 CD4+CD25+Tr 与 Tr1 是两种不 同的细胞亚型，有研究观察到小鼠 CD4+CD25+Tr 属于 CD45RBlow 群体，而 Tr1 在体外 由 CD45RA+初始细胞分化而来。 2 调节性 T 细胞的分离、纯化及克隆扩增方法 获得大量的调节性 T 细胞是对其进行研究的前提，正常情况下淋巴结、脾脏及外周血存 在一定数量的 CD4+CD25+Tr，可通过 CD 标记，免疫磁珠分选法获得大量 CD4+CD25+Tr。Trl 主要通过克隆扩增的方法获得，较为复杂。 2.1 CD4+CD25+Tr 的分离、纯化 制备单个细胞悬液，以 T 细胞纯化柱分离小鼠淋巴 结或脾脏 T 淋巴细胞，以抗-CD8-FITC 抗体和抗 FITC 标记磁珠相结合的阴性选择法剔除 CD8+T 细胞，再以抗-CD25-FITC 抗体和抗 FITC 标记磁珠相结合的阳性选择法选出 CD25+T 淋巴细胞。也可采用 CD4+T 细胞亚型纯化柱分离得到 CD4+T 细胞，再结合抗- CD25-FITC 抗体，以流式细胞仪分选出纯化的 CD4+CD25+T 细胞。 2.2 Trl 的克隆、扩增 Groux 等较早克隆扩增成功人和小鼠 Tr1，人 Trl 是在外源性 IL- 10 存在情况下，以外源性单核细胞刺激人外周血 CD4+T 细胞，10 d 后，以流式细胞仪筛 选出单个 CD4+T 细胞克隆并接种于培养孔，加入经照射的饲养细胞 （JY，105/ml,PBMC,106/ml）,以 10U/ml 的 rIL-2 和高剂量交叉结合的抗-CD3 单抗 （100g/ml）反复刺激扩增。小鼠 Trl 克隆通过有限稀释法获得，培养基中加入 OVA（2 mo/L）和经照射的脾 APC（107/ml），以 IL-2（20 U/ml）和 IL-4（20 U/ml）刺激进行 扩增。 3 调节性 T 细胞作用机制 活化的 CD4+CD25+Tr 主要通过接触抑制的方式抑制 T 细胞的活化和增殖。另外， CD4+CD25+Tr 还可分泌细胞因子 IL-10 和 TGF- 抑制免疫反应。CD4+CD25+Tr 接触抑 制的机制在于该细胞表达 CTLA-4，CTLA-4 跨膜分子胞内段携带免疫受者酷氨酸抑制基序 （ITIM），与 B7 配接后传递抑制信号，抑制 T 细胞的增殖和活化，用抗 CTLA-4 单抗可阻 断 CD4+CD25+Tr 的抑制作用。 前已提及，Trl 发挥免疫调节作用主要是通过分泌 IL-10 和 TGF- 来实现的，IL-10 和 TGF- 都是具有免疫抑制作用的细胞因子，二者抑制效应广泛。IL-10 可通过直接和间接机 制明显降低抗原特异性 T 细胞增殖。IL-10 对 T 细胞的直接作用包括抑制 IL-2 的产生以及 延长细胞增殖周期。间接机制包括下调 MHC 类分子的表达、下调单核细胞 CD80 和 CD86 的表达以及 T 细胞共同刺激分子 CD28 的配体。并且，通过抑制 APC，IL-10 有效抑 制 IL-12 的产生，而 IL-12 是 Thl 细胞分化的关键因子。IL-10 还可阻止 T 细胞受体介导的 CD4+T 细胞活化。以 IL-10 处理 T 细胞导致持久的抗原特异性 T 细胞无反应，以抗 CD3 和 CD28 抗体重新刺激细胞不能逆转 IL-10 诱导的 T 细胞无能，加入外源性的 IL-2 也不能 逆转 IL-10 诱导的 T 细胞无能。除了主动抑制 T 细胞增殖，在特定条件下， IL-10 可诱导 Trl 的分化，人和小鼠 CD4+T 细胞在 IL-10 存在时经慢性活化可产生 Trl，增强 Trl 的抑制 作用。IL-10 对其他炎症细胞也具有较强的抑制作用，可抑制单核细胞、巨噬细胞、中性 粒细胞及嗜酸粒细胞产生前炎症因子和趋化因子，并可抑制单核细胞产生 IL-10，提高 IL- 1 和 IL-1 的自然拮抗剂 IL-1RA 的产生。IL-10 还可抑制 APC HLA-DR 及多种共同刺激 分子如 CD54、CD80 和 CD86 的表达。IL-10 还可通过抑制嗜酸粒细胞表达 CD40 发挥抗 过敏效应，导致嗜酸粒细胞加速凋亡。在体内，IL-10 表现出较强的免疫抑制和抗炎效应， 在内毒素血症、自身免疫性甲状腺炎以及过敏原诱导的气道炎症小鼠模型中，IL-10 都表 现出保护作用。 TGF- 从三个方面对免疫功能起抑制作用：一是抑制免疫效应细胞的增殖；二是抑制免 疫效应细胞的分化和活性；三是抑制细胞因子的产生及其免疫调节作用。将 TGF- 加入到 非纯化入 T 淋巴细胞培养基抑制 IL-2 依赖性 ConA 诱导的增殖，同时 T 细胞表达的 IL-2R 和 CD71 下降。TGF- 可使葡萄球菌毒素刺激的鼠 CD8+T 细胞毒性减低 90%。混合淋巴 细胞反应开始加入 TGF- 可抑制细胞溶解效应细胞的产生，加入 IFN- 可逆转该效应。 TGF- 抑制新鲜分离的 T 细胞 IL-4 及 IFN- 的产生。 4 调节性 T 细胞的应用前景 Tr 所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的调节中具有广泛的应用前景，具有 许多研究显示调节性 T 细胞在 Th1 或 Th2 介导的疾病中具有良好效果。 4.1 炎症性肠病 在炎症性肠病（ IBD）小鼠模型，同时输入 Trl 细胞和致病性 CD4+CD45RBhiT 细胞可抑制严重免疫缺陷小鼠 IBD 的形成。该研究同时证实 Trl 必须在 体内被活化才能发挥调节作用，因为只有在接受的抗原可被 Trl 识别的小鼠中才能阻止 IBD 的形成。 Trl 克隆抑制免疫反应的特性与 CD45RBlowCD4+T 细胞相似，后者也可通过 IL-10 和 TGF- 依赖机制抑制 IBD。 4.2 移植免疫 诱导免疫耐受是移植成功的关键， Tr 在移植耐受中起重要调节作用。 Taylor 等研究显示，CD4+CD25+Tr 在移植物抗宿主病（GVHD）的发生过程中起重要作用， 在数个动物品系的组合中，不论全身放射剂量如何，去除供者 T 细胞接种物中 CD4+CD25+Tr 或移植前去除受者 CD25+T 细胞将导致 GVHD 的升高。输注新鲜纯化的供 者 CD4+CD25+Tr 和等量的 CD4+T 细胞可适度抑制 GVHD 的发生。而体外培养的活化 CD4+CD25+Tr 与等量的 CD4+T 细胞或去除 CD25+T 细胞输注明显抑制快速致死性 GVHD。 4.3 支气管哮喘 支气管哮喘是由 Th2 细胞介导的气道慢性炎症性疾病，结合在肥大细 胞、嗜碱粒细胞表面的抗原特异性 IgE 通过桥联抗原促使上述细胞释放炎症介质，在速发 相及迟发相哮喘反应中起重要作用。Cottrez 等研究发现，将 Trl 克隆转移入 OVA 诱导的速 发型超敏反应小鼠模型中，使抗原特异性 IgE 减少 90%，抗 IL-10 抗体可逆转 Trl 抑制抗 原特异性 IgE 的作用，说明 IL-10 在 Trl 的调节功能中起重要作用。给予 Trl 的小鼠淋巴结 T 细胞经 OVA 刺激后分泌的 IL-10 较对照组细胞明显升高，仅分泌少量的 IL-5，无 IL-4。 将抗原特异性 Tr 转移入致敏小鼠也可阻止气道高反应的形成。 Zuany-Amorim 等研究发现， 经灭活分析杆菌悬液 SRP299 处理的小鼠产生 CD4+CD45RBloqTr，可通过产生 IL-10 和 TGF- 抑制气道炎症的形成。 4.4 口服耐受及实验性自身免疫性脑脊髓炎 口服耐受是指通过预先口服抗原特异性抑 制细胞和（或）体液免疫，阻止机体对食物蛋白和细菌抗原的高反应性。口服低剂量抗原 可诱导产生分泌免疫抑制性细胞因子 TGF- 的调节性细胞，抑制实验性自身免疫性疾病的 发生。低剂量抗原经 Peyers patch 肠相关 APC 递呈后，优先诱导产生抗原特异性调节性 细胞，这种调节性细胞在体内外遇到抗原后可分泌 TGF-。而高剂量抗原口服不仅诱导克 隆无能和消除，也可诱导产生 TGF- 的调节性细胞，OVA TCR 转基因小鼠口服抗原也可诱 导产生 CD4+CD25+Tr，其抑制效应部分由 TGF- 介导。Chen 等研究发现，小鼠口服给予 髓磷脂碱蛋白可诱导周围耐受，其肠系膜淋巴结可分离出产生 TGF-、IL-10 及 IL-4 的 T 细胞克隆，抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的形成，此病是由 Th1 介导的多发生硬化动物模型。另外，Kohm 等研究发现，在体外，